唐古特大黃多糖組分1 對大鼠急性放射性腸損傷的保護作用

劉琳娜，張 甜，石 磊，張志培，李詩草，關 波，張文娟

第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院藥劑科，陜西 西安710038

放射性腸炎(radiation enteritis，RE)是腹盆腔及腹膜后腫瘤放療后最為常見、也最棘手的并發(fā)癥之一。RE 發(fā)生后，患者出現(xiàn)嚴重的腹痛、腹瀉、便次增多、黏液膿血便甚至鮮血便，加重患者的惡病質而影響療效，嚴重時甚至導致患者死亡，因此臨床上必須重視，嚴防發(fā)生［1］。但目前尚無特異性的針對RE 的有效預防藥物［2］。

本實驗室從唐古特大黃中提取、分離得到水溶性多糖，并經凝膠柱層析分離得到5 個不同分子量組分的大黃多糖(Rheum tanguticum polysaccharides，RTP 1-5)，動物實驗表明，RTP1［分子量(6 ～8)×105］能明顯降低2，4，6-三硝基苯磺酸誘導的結腸炎大鼠的死亡率，減輕結腸重量，縮小潰瘍面積，緩解黏膜水腫［3］;對正常大鼠小腸隱窩細胞IEC-6，RTP1 可通過清除多胺，使鳥氨酸脫羧酶(ODC)活性增高及蛋白表達增加促進腸上皮細胞的增殖、移行和分化［4］;以其預處理細胞后，可減少過氧化氫誘導的腸上皮細胞凋亡，增強細胞活力［5］，但RTP1 對輻射腸損傷的作用尚不明確，本實驗通過建立大鼠急性腸輻射損傷模型，觀察RTP1對射線所致腸黏膜損傷的防護作用，為尋找新的、具有放射性腸損傷保護作用的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 近交系成年雄性SD 大鼠，體質量220 ～250 g［動物合格證號:SCXK(軍)第2012-0007 號］，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。RTP1 采用水提醇沉法得到粗多糖，之后分別經DEAE-52 柱(上海銳谷生物科技有限公司)層析、Sephacryl S-200 凝膠柱(GE China-Healthcare)層析分離純化后，得到多糖組分1(RTP1)。使用前將RTP1以PBS 溶液(pH 7.4)溶解。還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，內毒素、二胺氧化酶(DAO)及D-乳酸酶聯(lián)免疫試劑盒均購自上海卓康生物公司;Varian Clinac 23EX 醫(yī)用直線加速器，LEICA普通光學顯微鏡，Leica 圖像分析儀、722 型光柵分光光度計。

1.2 急性放射性腸炎動物模型的制作 大鼠禁食12 h 后以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于自制木質鼠板上，以6 MV 直線加速器行X 射線全腹部(劍突下至恥骨聯(lián)合)照射，源皮距80 cm，照射劑量10.0 Gy，劑量率4.0 Gy/min，制作穩(wěn)定的、適合研究用的SD 大鼠急性放射性腸炎模型。

1.3 動物分組及處理 60 只SD 雄性大鼠隨機分為5 組:(1)單純照射組(IC 組);(2)正常對照組(灌胃給予PBS，連續(xù)7 d);(3)RTP1 高劑量組(灌胃給予RTP1 800 mg/kg，連續(xù)7 d);(4)RTP1 中劑量組(灌胃給予RTP1 400 mg/kg，連續(xù)7 d);(5)RTP1 低劑量組(灌胃給予RTP1 200 mg/kg，連續(xù)7 d)，給藥結束后上述各組動物均接受10.0 Gy 6 MV 高能X 射線單次腹部照射1 次;照射結束后第3 天禁食12 h，進行指標檢測。

1.4 檢測指標

1.4.1 腸黏膜病理組織學改變:大鼠處死后，即刻取距屈氏韌帶10 cm 處2 cm 小腸標本，40 g/L 中性甲醛溶液固定，6 μm 厚石蠟切片，HE 染色，光鏡下觀察腸黏膜形態(tài)結構;用Leica 圖像分析儀分別隨機全盲測定3 張非連續(xù)切片各10 個絨毛數(shù)量和高度，絨毛高度為從長絨毛基部到頂端的長度，取其均值［6］。

1.4.2 腸屏障功能障礙指標:無菌狀態(tài)下心臟穿刺取血5 ml，3 000 r/min 、4 ℃離心10 min，取血漿，-20℃保存，以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿中DAO、D-乳酸及內毒素含量。

1.4.3 腸組織氧化還原酶GSH、SOD、MDA 活性測定:取末端回腸組織4 cm，用預冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干稱重，置玻璃勻漿管中，加入冷生理鹽水，以20 000 r/min 勻漿10 s，間歇30 s，反復進行3 次，制成10%組織勻漿，4 000 ×g 離心15 min 取上清，分別按照GSH、SOD、MDA 試劑盒說明書進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)以s 表示，統(tǒng)計方法使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較使用q 檢驗，檢驗水平(α)為0.05，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RTP1 對輻射大鼠腸黏膜組織病理形態(tài)改變實驗結果表明，IC 組大鼠全部出現(xiàn)腹瀉，排不成形含大量水和黏液的稀便，稀便率為100%，同時大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、皮毛色澤下降、肛門周圍污濁等，且體質量下降;正常對照組則體質量繼續(xù)增長，RTP1 預處理組3 d 后，大便形狀有一定改善，黏液較少，但與正常組比仍較濕軟，對正常對照組大鼠進行解剖后發(fā)現(xiàn)，腸管呈粉紅色，無充血、水腫、腸腔擴張，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該組大鼠小腸黏膜絨毛排列整齊、緊湊，輪廓清晰，表面結構完整，絨毛高度和隱窩深度均較大;IC 組大鼠腸管呈暗紅色，腸腔擴張、充血，腸壁變薄、黏膜出血，甚至有潰瘍和穿孔，光鏡下觀察則可見小腸黏膜上皮廣泛剝脫、壞死，絨毛明顯萎縮變短、變禿，且排列雜亂、無序，表面結構不完整，有廣泛的破損現(xiàn)象;RTP1 預處理組腸黏膜情況明顯好于IC 組，腸腔擴張、腸黏膜充血明細減輕，光鏡下觀察也可發(fā)現(xiàn)，小腸黏膜絨毛排列較為整齊和有序，絨毛雖然也有萎縮，但與IC 組相比程度較輕(見圖1)。各組大鼠小腸絨毛高度和絨毛數(shù)量測量結果:與正常對照組比較，IC組小腸絨毛高度和數(shù)量均明顯下降(P ＜0.05);RTP1各組絨毛的高度和寬度略有下降，高劑量組絨毛的高度與正常對照組比較無明顯差異，與IC 組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);中、低劑量組絨毛高度和寬度雖較IC 組高，但差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，見表1)。

表1 RTP1 對輻射大鼠小腸絨毛高度和隱窩深度的影響(s)Tab 1 Effects of RTP1 on villus height and crypt depth after radiation (s)

表1 RTP1 對輻射大鼠小腸絨毛高度和隱窩深度的影響(s)Tab 1 Effects of RTP1 on villus height and crypt depth after radiation (s)

注:與正常對照組相比，* P ＜0. 01;與IC 組相比，●P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別 例數(shù)照射組絨毛高度(μm) 隱窩深度(μm)12 322.70 ±16.54 121.20 ±18.24 IC 組 12 108.33 ±13.96* 47.11 ±5.86*RTP1 高劑量組 12 304.35 ±22.53▲ 71.98 ±10.71▲RTP1 中劑量組 12 281.74 ±41.32▲ 61.37 ±10.58▲RTP1 低劑量 12 127.12 ±12.91● 53.33 ±11.72正常對照組●

2.2 大鼠血漿中DAO、D-乳酸及內毒素檢測結果IC 組血漿DAO、D-乳酸及內毒素含量均較正常對照組高(P ＜0.05)，且DAO、D-乳酸與內毒素的含量變化呈正相關;以RTP1 預處理后，各劑量組血漿DAO 及D-乳酸均顯著降低(P ＜0.05)，內毒素含量也低于IC 組(P ＜0.05)，低劑量組雖然也有降低血漿內毒素含量的趨勢，但與IC 組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，見表2)。

圖1 光鏡下各組大鼠小腸黏膜膜形態(tài)觀察(HE 染色) A:正常對照組，小腸黏膜絨毛排列整齊、上皮細胞形態(tài)正常，未見黏膜充血、水腫及炎細胞浸潤等表現(xiàn);B:IC 組，大鼠小腸黏膜絨毛稀疏、萎縮，黏膜水腫，其腺隱窩深度和絨毛高度均較正常對照組顯著減少;C:RTP1 高劑量組大鼠腺隱窩深度、腸黏膜厚度和絨毛高度均較IC 組明顯增加Fig 1 Representative images showed height of villi and crypt cell survival in the intestinal circumference of different groups (HE staining) A:the control group had neat and compact mucosa villi，and their small intestinal villi had a clear outline. There was no mucosal hyperemia and edema and inflammatory cell infiltration;B:the small intestinal mucosa epithelium of the rats in the IC group was stripped，shortened，disorderly and necrotic. The villus height and crypt depth were significant decreased compared with IC group;C:in the RTP1 high dose group，the thickness of intestinal mucosa，villus height and crypt depth were significant increased compared with IC group

表2 RTP1 對大鼠血漿中DAO、D-乳酸及內毒素含量的影響(s)Tab 2 Effect of RTP1 on DAO，D-lactate and endotoxin levels in blood plasma (s)

表2 RTP1 對大鼠血漿中DAO、D-乳酸及內毒素含量的影響(s)Tab 2 Effect of RTP1 on DAO，D-lactate and endotoxin levels in blood plasma (s)

注:與正常對照組相比，* P ＜0.01;與IC 組相比，▲P ＜0.05，●P ＜0.01。

組別 例數(shù) DAO(U/L) D-乳酸(U/L) 內毒素(EU/L)12 42.28 ±6.98 15.68 ±4.91 0.023 ±0.004 IC 組 12 97.34 ±13.65* 59.48 ±9.78* 0.067 ±0.071*RTP1 高劑量組 12 63.22 ±8.98● 30.56 ±8.45● 0.036 ±0.012●RTP1 中劑量組 12 78.52 ±7.89● 34.89 ±9.77● 0.031 ±0.009●RTP1 低劑量組 12 88.56 ±6.98▲ 42.81 ±7.32▲正常對照組0.059 ±0.006

2.3 腸組織中GSH、SOD、MDA 含量變化 與正常對照相比，IC 組大鼠小腸組織中MDA 含量均顯著升高(P ＜0.05)，GSH 含量及SOD 活性顯著降低(P ＜0.05)。與IC 組比較，RTP1 高劑量組和中劑量組GSH、MDA 含量顯著降低(P ＜0. 05)，GSH 含量及SOD 活性明顯升高(P ＜0.05)，低劑量組MDA 含量變化不顯著，與IC 組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，但SOD 活性與IC 組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，見表3)。

表3 RTP1 對大鼠小腸組織GSH、SOD、MDA 水平的影(s)Tab 3 Effect of RTP1 on the SOD activity，MDA content and GSH activity in the intestine of rats after radiation (s)

表3 RTP1 對大鼠小腸組織GSH、SOD、MDA 水平的影(s)Tab 3 Effect of RTP1 on the SOD activity，MDA content and GSH activity in the intestine of rats after radiation (s)

注:與正常對照組相比，* P ＜0.01;與IC 組相比，●P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別 例數(shù) GSH(nmol/mg) SOD(mU/mg) MDA(nmol/mg)

3 討論

腸道上皮細胞增殖迅速，是除骨髓之外對輻射最為敏感的細胞，射線導致腸隱窩上皮細胞增殖抑制、凋亡和壞死，從而使小腸絨毛高度降低、黏膜萎縮，腸黏膜屏障損傷，細菌移位和內毒素血癥［7］。本研究證實，RTP1 對2，4，6-三硝基苯磺酸、過氧化氫所致腸黏膜損傷具有一定的保護作用，但RTP1 對輻射腸黏膜損傷是否具有保護作用尚不明確。

腸黏膜屏障功能的狀況是診斷腸黏膜屏障功能障礙的重要依據(jù)，臨床上常用的方法如血中D-乳酸檢測、血漿內毒素檢測及DAO 檢測等［8］。腸黏膜細胞受損傷后，細胞間的緊密連接被破壞，腸通透性增加，D-乳酸作為腸道多種細菌均可產生的發(fā)酵代謝產物，是腸屏障功能損害、腸通透性增加的有效預警指標，DAO是大部分存在于小腸黏膜絨毛中的細胞內酶，其活性與絨毛高度和黏膜細胞內的核酸與蛋白質合成密切相關，是反映小腸黏膜結構與功能的理想指標，外周血中內毒素水平也是評價腸屏障功能的重要手段，當腸屏障發(fā)生功能障礙時，腸道中的內毒素穿過破損的腸黏膜進入血液循環(huán)，嚴重時甚至形成內毒素血癥。

本研究采用6 MV 直線加速器進行總劑量10 Gy X 射線單次照射的方式建立急性大鼠SD 模型，大鼠腸管腸腔擴張、充血，腸壁變薄、黏膜出血、甚至有潰瘍和穿孔，光鏡下可見腸絨毛明顯變短、結構紊亂，同時血漿中DAO 活性和D-乳酸濃度均明顯升高，且與內毒素的濃度變化具有良好的相關性，當給予RTP1 預處理后，RTP1 預處理組腸黏膜情況明顯好于單純照射組，腸腔擴張、腸黏膜充血明顯減輕，光鏡下觀察也可發(fā)現(xiàn)，小腸黏膜絨毛排列較為整齊和有序，絨毛雖然也有萎縮，但與IC 相比程度較輕，絨毛高度和隱窩深度均較模型組有一定改善，血漿中DAO 活性、D-乳酸濃度及內毒素水平均降低，表明腸黏膜屏障得到一定保護。

氧自由基損傷是輻射所致腸黏膜損傷的最主要因素［9］，SOD 是機體內清除氧自由基的重要酶之一，其活力和含量反映了機體清除氧自由基的能力，SOD 是重要的抗氧化酶，此酶能清除超氧陰離子自由基()，保護細胞免受損傷，保護腸道免受輻射損傷的影響，MDA 是脂質過氧化的最終產物，其含量可直接反映組織脂質過氧化程度，測試MDA 的量?？煞从持|過氧化的程度，間接反映細胞受損傷的程度，GSH在清除ROS、維持組織細胞的氧化還原平衡中發(fā)揮重要作用，本實驗結果發(fā)現(xiàn)，輻射后大鼠小腸組織中SOD 活性及GSH 含量明降減低、MDA 含量明顯升高，RTP1 預處理后可以拮抗以上改變，說明大鼠接受10.0 Gy X射線單次腹部照射后小腸組織細胞內氧化還原酶平衡遭到破壞，RTP1 可通過其抗氧化性清除ROS，保護腸黏膜免受損傷，從而降低腸通透性，使得腸黏膜得以保存結構和功能的相對完整。

綜上所述，RTP1 可在一定程度上保護腸黏膜免受輻射損傷，胃腸腸黏膜屏障的功能，該作用的發(fā)揮可能與其減輕脂質過氧化損傷有關，但具體作用機制尚需進一步探討。

［1］ Stacey R，Green JT. Radiation-induced small bowel disease:latest developments and clinical guidance［J］. Ther Adv Chronic Dis，2014，5(1):15-29.

［2］ Shadad AK，Sullivan FJ，Martin JD，et al. Gastrointestinal radiation injury:Prevention and treatment［J］. World J Gastroenterol，2013，19(2):199-208.

［3］ Liu L，Guo Z，Lv Z，et al. The beneficial effect of Rheum tangguticum polysaccharide on protecting against diarrhea，colonic inflammation and ulceration in rats with TNBS-induced colitis:the role of macrophage mannose receptor in inflammation and immune response［J］. Int Immunopharmacol，2008，8(11):1481-1492.

［4］ Liu LN，Mei QB，Wang ZP，et al. Promoting effects of Rheum tanguticum polysaccharide on IEC-6 cell proliferation，migration and its possible mechanism［J］. Chinese Pharmacological Bulletin，2008，24(3):303-307.劉琳娜，梅其炳，王志鵬，等. 唐古特大黃多糖促進IEC-6 細胞增殖、移行作用及其可能的機制研究［J］. 中國藥理學通報，2008，24 (3):303-307.

［5］ Liu LN，Mei QB，Liu L，et al. Protective effects of Rheum tanguticum polysaccharide against hydrogen peroxide-induced intestinal epithelial cell injury［J］. World J Gastroenterol ，2005，11(10):1503-1507.

［6］ Park E，Hwang I，Song JY，et al. Acidic polysaccharide of Panaxginseng as a defense against small intestinal damage by whole-body gamma irradiation of mice［J］. Acta Histochemica，2011，113(1):19-23.

［7］ Shadad AK，Sullivan FJ，Martin JD，et al. Gastrointestinal radiation injury:Symptoms，risk factors and mechanisms［J］. World J Gastroenterol，2013，19(2):18-198.

［8］ Wang CC，Wang XT，Cheng C. The application and evaluation index of mucosal barrier function［J］. Medical Recapitulate，2010，16(4):623-625.王翠翠，王曦滔，程辰. 腸黏膜屏障功能評價指標的檢測和應用［J］.醫(yī)學綜述，2010，16(4):623-625.

［9］ Gao JS，Yang SL. Advance in causes and mechanisms of intestinal injury［J］. World Chinese Journal of Digestology，2009，17(5):1540-1544.高金生，楊書良. 腸黏膜屏障損傷的原因與機制研究進展［J］. 世界華人消化雜志，2009，17(5):1540-1544.