杜泊羊兩種沖胚方法胚胎移植效果的比較

王賽賽，韓帥兵，陳其新，石 崗，李書舉，寧洋洋（河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州450002）

杜泊羊兩種沖胚方法胚胎移植效果的比較

王賽賽，韓帥兵，陳其新，石 崗，李書舉，寧洋洋
（河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州450002）

為篩選適宜中原地區(qū)肉用綿羊快速擴繁的方法，采用輸卵管沖胚法和子宮角沖胚法分別處理87只杜泊羊和43只杜泊羊，統(tǒng)計兩種沖胚方法的只均獲得胚胎數(shù)、只均獲得可用胚胎數(shù)、移植妊娠率及術后粘連率等指標，分析兩種胚胎移植效果的差異。結果表明：輸卵管沖胚法獲得的只均胚胎數(shù)、只均獲得可用胚胎數(shù)均略高于子宮角沖胚法,但二者差異不顯著（P＞0.05）。子宮角沖胚法術后發(fā)生粘連率較輸卵管沖胚法術后發(fā)生粘連率低6.47個百分點，但同樣差異不顯著（P＜0.05）。因此，子宮角沖胚法胚胎移植后粘連率相對較低，是中原地區(qū)杜泊羊快速擴繁比較適宜的方法。

杜泊羊；輸卵管沖胚；子宮角沖胚；胚胎移植；粘連率

杜泊羊是南非用有角陶賽特羊與波斯黑頭羊雜交育成的肉用綿羊品種。它能適應各種氣候，具有早期生長發(fā)育快、胴體瘦肉率高、肉質細嫩、耐熱、耐粗飼、可常年發(fā)情配種等特點，杜泊羊因肉質細嫩可口，被國際市場譽為“鉆石級”綿羊肉，已被世界各國廣泛引種［1］。近年來，中原農區(qū)各地相繼引入杜泊羊，開展地方品種雜交改良，成為最受歡迎的終端父本。但目前種羊市場價格居高不下，嚴重制約了肉羊業(yè)的發(fā)展。為此，河南中鶴牧業(yè)有限公司從澳大利亞引進2 000只優(yōu)質杜泊種羊，期望通過種羊擴繁，為市場提供優(yōu)質廉價的種羊。

胚胎移植（MOET）技術是最重要的現(xiàn)代動物繁殖生物技術之一，可挖掘優(yōu)秀種母羊的繁殖潛力、實現(xiàn)種羊的快速擴繁。國內外肉羊胚胎移植操作中常用的操作方法包括輸卵管沖胚法和子宮角沖胚法［2］，二者各有優(yōu)、缺點。目前，肉羊MOET技術尚未在中原地區(qū)實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化應用，相關技術仍需進一步完善。為此，作者等在內蒙古大學王建國研究員及澳大利亞專家指導下，開展胚胎移植等現(xiàn)代繁殖生物技術的研究應用，對常用的兩種肉羊胚胎移植技術效果進行了對比分析，旨在探索杜泊羊胚胎移植的適宜操作方法，提高優(yōu)秀種羊的繁殖效率，完善杜泊羊胚胎移植技術體系，促進中原肉羊業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供受體羊的選擇和管理

以優(yōu)質純種杜泊綿羊為供體，湖羊為受體。在胚胎移植處理開始前，對供、受體母羊均用B超進行檢測，15 d后重復檢測1次。將挑選出來的適宜母羊單獨飼養(yǎng)，加強飼養(yǎng)管理并杜絕和公羊的任何接觸。杜泊種公羊不參加日常配種工作，補充精料并每天飼喂2枚雞蛋。

1.2 試驗器械

腹腔內窺鏡，子宮鉗，剪刀，止血鉗，沖胚管，培養(yǎng)皿，手術刀片，醫(yī)用縫合線，注射器，胚胎移植手術架，留置針，消毒衛(wèi)生紙，醫(yī)用噴壺，鑷子，體視顯微鏡，移植針，記號筆，等等。

1.3 試驗藥品

孕激素海綿栓，新西蘭哈密爾頓生物公司；CIDR，新西蘭哈密爾頓生物公司；垂體促卵泡素（FSH），100 IU/支，寧波市激素制品有限公司；氯前列烯醇（PG），0.2mg/支，上海市計劃生育研究所；促黃體素（LH），100 IU/支，寧波市激素制品有限公司；孕馬血清（PMSG），寧波市激素制品有限公司；沖胚液，1 000mL/袋，BIONICHE ANIMAL HEALTH USA。其它藥品包括陸眠寧、陸醒寧、碘伏、酒精、土霉素等。

1.4 供、受體羊的管理

在胚胎移植開始前1個月，對供體（杜泊羊）、受體（湖羊）進行補飼。供體羊日均采食量1.5 kg（干物質），受體羊日均采食量1.2 kg（干物質）。日糧配方組成：玉米青貯2.0 kg，羊草1.0 kg，精料0.6 kg，胡蘿卜0.5 kg。日糧配方營養(yǎng)成分：粗蛋白206.86 g，粗脂肪69.25 g，粗纖維459.86g，鈣11.17g，磷7.00g，食鹽3.00g，消化能20.29MJ。

1.5 受體同期發(fā)情處理

采用海綿栓+PMSG+PG法。即受體與同一批供體同步埋植海綿栓13 d，將埋植當天記為0 d，于海綿栓埋植的第12天下午肌肉注射PG 0.1mg，在撤栓（第13天）的同時每只羊肌肉注射PMSG 250 IU。

表1 供體羊超數(shù)排卵及撤栓方案

1.6 供體羊的超數(shù)排卵處理

采用CIDR+FSH+PG法。即在供體羊陰道內放入CIDR，埋植當天記為0 d，從埋植的第11天下午開始肌肉注射FSH，以遞減劑量的方法注射3 d，共6次，每次間隔12h，在第5次注射FSH的同時肌肉注射PG 0.1mg/只并撤栓。在撤栓后12 h進行FSH的第6次處理。

1.7 配種方式

超排供體羊發(fā)情后用公羊試情，在撤栓后36 h集中采用腹腔鏡技術進行子宮角輸精。

1.8 胚胎的采集

采用兩種方法進行胚胎采集。第1種方法是子宮角采集胚胎，即在超排羊配種后的第6天（供體羊配種后2～3d）采卵。將沖卵管一端由輸卵管傘部的喇叭口插入2～3 cm深，另一端接集卵皿。用注射器吸取37℃的沖卵液5～10mL，在子宮角靠近輸卵管的部位，將針頭朝輸卵管方向扎入。1人操作，用一只手的手指在針頭方向后捏緊子宮角，防止沖卵液流入子宮，另一只手推注射器，沖卵液由宮管結合部流入輸卵管，經輸卵管流至集卵皿。第2種方法是輸卵管采集胚胎，即在超排羊配種后的第2天，用常規(guī)手術法將供體羊麻醉，腹部切口。用子宮鉗輕輕緩慢地將子宮角牽引到腹腔外，在一側子宮角基部用鈍鉗刺透子宮壁，插入沖卵導管，向沖卵管氣囊打氣3～5mL。在宮管結合部插入套管針，抽出針芯，并由此向子宮腔內注入沖卵液。注入沖卵液的方法：先注入沖卵液20～25mL，再注入空氣5～10mL，以保證胚胎的有效回收。用培養(yǎng)皿接收回流沖卵液，最后用手指輕輕壓擠子宮角，讓沖卵液回收完全，然后氣囊放氣，子宮角基部縫合。供體羊在手術前肌注陸眠寧0.5mL/只、手術結束后肌注陸醒寧1mL/只，同時肌注抗生素，防止繼發(fā)感染。

1.9 胚胎的檢查與鑒定

胚胎采出后，在20～40倍體視顯微鏡下觀察受精卵的形態(tài)、色調、分裂球的大小、均勻度、細胞的密度與透明帶的間隙以及變性情況。按照形態(tài)鑒定法對胚胎進行分級，并做好詳細記錄。

1.10 胚胎移植

選擇與供體發(fā)情時間相差1 d以內的羊進行移植。用子宮角沖胚法沖胚的將胚胎移植到子宮角，采用輸卵管沖胚的將胚胎移植到輸卵管的相應部位。采用邊沖胚邊移植的方法，避免胚胎在體外長時間的存放。手術移植時，牽引出卵巢或用腹腔鏡觀察卵巢上黃體的發(fā)育情況，將胚胎移植到有黃體的輸卵管中部或子宮角前1/3處。

1.11 統(tǒng)計分析

記錄同期發(fā)情處理后不同品種、不同時間段的發(fā)情母羊數(shù)，采用SPSS 22.0軟件進行分層卡方檢驗，即以品種為行因子，以發(fā)情狀況作為列因子，以時間段作為分層因子。對兩種方法超排效果分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，進行獨立樣本t檢驗。對超排、移植相關百分率數(shù)據(jù)均采用卡方檢驗。

2 結果與分析

2.1 供受體同期發(fā)情效果

由表2可見，在撤栓后48 h內，供、受體母羊的總體同期發(fā)情率沒有顯著差異（P＞0.05），但杜泊羊和湖羊撤栓后表現(xiàn)的發(fā)情規(guī)律不同：杜泊羊發(fā)情早，在撤栓后12～24 h內出現(xiàn)發(fā)情高峰期，36 h內全部高發(fā)情；湖羊發(fā)情較遲，發(fā)情高峰期出現(xiàn)在24～36 h內。兩個品種母羊相應時間段的發(fā)情率間均存在極顯著差異（P＜0.01）。

表2 供、受體羊同期發(fā)情率的比較%

2.2 供體羊的超排效果

由表3可見，在輸卵管沖胚胎法組中，87只杜泊羊中77只供體采到胚胎，采胚成功率88.51%，共獲胚胎394枚，其中可用胚胎376枚，可用胚胎率95.43%。在子宮角沖胚胎法組中，43只杜泊羊中39只供體采到胚胎，采胚成功率90.70%，共獲胚胎180枚，其中可用胚胎174枚，可用胚胎率96.67%。兩種沖胚法采胚成功率、可用胚胎 率、只均獲胚胎數(shù)及只均可用胚胎數(shù)均無差異（P＞0.05）。

表3 不同沖胚方法對杜泊羊沖胚效果的影響

2.3 胚胎移植妊娠結果

將兩種方法沖出的部分胚胎進行移植，受體母羊受胎結果見表4。由表4可見，兩種沖胚方法沖出的胚胎經移植后的受胎率無顯著差異（P＞0.05）。

表4 胚胎移植到受體后的妊娠情況

2.4 兩種沖胚方法術后粘連情況

胚胎移植結束后，對處理的供體羊隨機挑選出部分羊，用腹腔鏡觀察術后粘連情況，結果見表5。結果顯示，子宮角法胚胎移植后的粘連率有降低趨勢，但與輸卵管法粘連率間差異不顯著（P＞0.05）。

表5 兩種沖胚方法術后粘連情況

3 討論

研究表明，供體、受體母羊的發(fā)情同步差對受胎率有顯著影響［3］。若供、受體同期發(fā)情的同步差在12 h以內，胚胎移植技術效率高。本試驗中的供體是經過嚴格挑選的健康狀況良好、膘情合適、能夠自然發(fā)情，且至少自然生產過1胎的羊，所以同期發(fā)情效果總體比較理想，杜泊母羊在撤栓后36 h全部發(fā)情。受體湖羊在撤栓后48 h發(fā)情率達92.26%，但發(fā)情高峰期較杜泊羊遲12 h左右。這種發(fā)情時間的差異，可能對胚胎移植總體效率產生一定影響。

應用相同的超數(shù)排卵方案，對杜泊羊進行相同的處理，兩種沖胚法的胚胎回收率、獲得的可用胚胎率等指標均差異不顯著（P＞0.05）。一般認為，輸卵管法可沖出更多的胚胎，體現(xiàn)更好的超排效果。但由于胚胎發(fā)育階段較早，輸卵管法所獲部分胚胎發(fā)育不良，胚胎的可利用率和移植后的受胎率并不高。相對而言，子宮角沖胚法獲得的頭均胚胎數(shù)一般低于輸卵管法，但沖出的胚胎大多是桑椹胚或囊胚，發(fā)育階段靠后，對外界環(huán)境有更大的抵抗力，所以胚胎的可利用率和移植后的受胎率較高。本試驗在同一飼養(yǎng)環(huán)境中進行兩種方法移植效果比較，證實了上述觀點［4-8］。應用兩種沖胚法進行胚胎移植比較試驗，雖然各技術指標均未發(fā)現(xiàn)顯著差異，但輸卵管沖胚法所獲胚胎數(shù)、術后粘連率比子宮角沖胚法有升高趨勢。綜合分析來看，在中原地區(qū)進行杜泊羊胚胎移植，以子宮角沖胚法較好。

［1］ 徐小波，王公金，儲國良，等.杜泊羊冷凍胚胎移植的影響因素［J］.江蘇農業(yè)學報，2007，23（6）：598-601.

［2］ CN-NY.綿羊胚胎移植技術規(guī)程［S］.2004.

［3］ 楊昇，馮建忠，張金龍，等.影響羊胚胎移植妊娠率的因素分析［J］.中國畜牧雜志，2005（7）：41-43.

［4］ 侯引緒.絨山羊植入波爾山羊胚胎分娩及助產結果分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，1998（10）：13-14.

［5］ 劉忠琛，尹懷磊，劉洪江.羊胚胎移植的實用操作技術［J］.當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2009（3）：9-12.

［6］ 孫尚信，黃玉琴.環(huán)境因素對羊胚胎移植妊娠率的影響［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2008（5）：149-152.

［7］ 王玉琴，趙有璋.綿羊胚胎移植關鍵技術［J］.中國草食動物，2004，24（增刊）：82-84.

［8］ 孫尚信.羊胚胎移植術后并發(fā)癥的預防與處理［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009（5）：178-179.

S826.3

A

2095-3887（2015）04-0024-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.007

2015-05-28

王賽賽（1987-），男，碩士研究生。

陳其新（1965-），男，副教授，博士。研究方向：肉羊分子遺傳與現(xiàn)代生物技術繁育。