浙江省柿樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系鑒定

程詩明，童 敏，梁君瑛*，應(yīng)尚蛟，康志雄，胡真明，陳友吾，葉長飛

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省海寧市林業(yè)技術(shù)服務(wù)站，浙江 海寧 314400；3. 浙江省永康市林業(yè)局，浙江 永康 321300；4. 浙江省林業(yè)廳，浙江 杭州 310020；5. 浙江省永康市舟山鎮(zhèn)人民政府，浙江 永康 321300；6. 浙江省云和縣林業(yè)局，浙江 云和 323600）

浙江省柿樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系鑒定

程詩明1，童 敏2，梁君瑛1*，應(yīng)尚蛟3，康志雄4，胡真明5，陳友吾1，葉長飛6

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省海寧市林業(yè)技術(shù)服務(wù)站，浙江 海寧 314400；3. 浙江省永康市林業(yè)局，浙江 永康 321300；4. 浙江省林業(yè)廳，浙江 杭州 310020；5. 浙江省永康市舟山鎮(zhèn)人民政府，浙江 永康 321300；6. 浙江省云和縣林業(yè)局，浙江 云和 323600）

采用表型性狀分析結(jié)合RAPD技術(shù)對9個浙江省優(yōu)良農(nóng)家柿樹品種40個單株進(jìn)行分析，從形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)兩方面說明其遺傳變異特征和本質(zhì)，表型形狀聚類結(jié)果表明，以1.5的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，可以將9個品種劃分為2類；利用RAPD相似系數(shù)矩陣按UPGMA進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果與表型形狀聚類結(jié)果基本一致。。

柿；種質(zhì)資源；表型性狀；RAPD

柿（Diospyros kaki）為柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros）植物，落葉喬木，果實(shí)具有較高的營養(yǎng)價值，且經(jīng)濟(jì)效益高、壽命長。浙江省是柿樹栽培大省，柿的栽培歷史久、分布范圍大，柿樹資源豐富，但柿樹種內(nèi)變異極為豐富，芽變品種多，在長期引種和栽培過程中，同物異名和同名異物現(xiàn)象嚴(yán)重，品種間的親緣關(guān)系不甚明了，嚴(yán)重影響了柿優(yōu)良品種的推廣、育種親本的選配和栽培適地的選擇[1~3]。傳統(tǒng)的鑒別方法存在一定的局限性，分辨率不高。

品種（系）鑒定與分類是DNA分子標(biāo)記應(yīng)用最早的領(lǐng)域之一。DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接從DNA分子水平上對果樹品種（系）進(jìn)行鑒定和分類，具有不受環(huán)境、取樣部位和發(fā)育階段的影響，檢出的多態(tài)位點(diǎn)是無限的優(yōu)點(diǎn)，較之根據(jù)形態(tài)學(xué)、園藝學(xué)和生理學(xué)特征進(jìn)行分類鑒定的方法，準(zhǔn)確性更強(qiáng)，效率更高，信息量更大，近幾年已得到廣泛應(yīng)用。其中，RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)，是建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)基礎(chǔ)上、繼限制性片斷長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polimorphism，RFLP）標(biāo)記技術(shù)之后發(fā)展起來的一種DNA多態(tài)標(biāo)記技術(shù)，它無需預(yù)先知道基因組序列，無需使用同位素或其他放射性標(biāo)記，在病原微生物的分型鑒定、物種的親緣關(guān)系分析、遺傳育種研究和特異表達(dá)基因的克隆與鑒定等諸方面得到了迅速而廣泛的應(yīng)用[4~5]。根據(jù)近幾年的研究統(tǒng)計，采用RAPD技術(shù)對果樹品種鑒定的樹種已涉及無花果、香蕉、杏、柑橘、柿、葡萄、蘋果梨、梅、板栗、油橄欖、龍眼、核桃、棗等[6~11]。

本研究采用形態(tài)指標(biāo)觀察、描述、測定的方法，結(jié)合RAPD技術(shù)對9個浙江省優(yōu)良農(nóng)家柿樹品種/類型40個個體的形態(tài)特征和RAPD擴(kuò)增帶進(jìn)行了研究，從形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)兩方面說明其遺傳變異特征和本質(zhì)，為浙江省柿樹品種/類型的鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在收集浙江省柿樹種質(zhì)資源分布資料和實(shí)地勘察的基礎(chǔ)上，于2006年選擇了9個浙江省農(nóng)家柿樹品種/類型，40個單株進(jìn)行采樣。分別為：淳安千島湖無核柿（QD）6個優(yōu)良單株 、蘭溪大紅柿（LX）5個優(yōu)良單株、永康方山柿（YK）5個優(yōu)良單株、永康柿棗（YK6）1株、天臺朱紅柿砧木（TT1）1株、天臺朱紅柿（TT）3個優(yōu)良單株、永嘉東皋柿（DG）6個優(yōu)良單株 、玉環(huán)長柿（YH）7個優(yōu)良單株、杭州蔣村扁花柿（JC）6個優(yōu)良單株（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)材料Table 1 Experimental materials

在每個優(yōu)良單株東、南、西、北4個方向的中、上部隨機(jī)采取5 ~ 8個果實(shí)；隨機(jī)采集成熟葉片不少于30片，壓制成標(biāo)本，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行測量。

采集秋稍徒長枝上的葉片和樹冠外圍生長健壯、無病蟲害枝條上剛展開的幼枝，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)鑒定

1.2.1.1 表型性狀測定 主要選擇相對穩(wěn)定、比較容易測量的表型性狀8個，分別為葉片長、葉片寬、葉柄長、果實(shí)長、果實(shí)寬、果柄長、單果重、果體積。根據(jù)葉片長、寬與果實(shí)長、寬分別計算出葉片長寬比和果實(shí)長寬比。

葉片寬、葉柄長、果柄長用直尺測定，測量精度為0.1 cm；果實(shí)長、果實(shí)寬用游標(biāo)卡尺測定，測量精度為0.1 mm；單果重用電子天平測定，測量精度為0.01 g；果體積用等體積轉(zhuǎn)化法（等體積轉(zhuǎn)換法是根據(jù)被測物密度不小于水的特點(diǎn)用大量器盛滿水，將被測物放入盛滿水的大量器，用量器測量溢出水的體積即為被測物的體積）測定，測量精度為0.1 cm3。

1.2.1.2 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SAS7.0進(jìn)行方差分析及聚類分析。

1.2.2 分子標(biāo)記RAPD鑒定

1.2.2.1 DNA的提取和純化 采用改良的SDS-CTAB法[12~13]提取樣品DNA，純化采用MagaZorb試劑盒。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，自動凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）觀察拍照，并用紫外分光光度計測定DNA樣品的濃度。

1.2.2.2 引物的篩選 實(shí)驗(yàn)所用的RAPD隨機(jī)引物購自上海生工生物公司。引物的篩選首先是用兩個柿樹DNA模板對200條寡核甘酸引物進(jìn)行第1次篩選，選出有擴(kuò)增帶且譜帶清晰的引物。然后再進(jìn)行第2次篩選，最后選出多態(tài)性強(qiáng)、擴(kuò)增條帶清晰的引物用于樣品RAPD分析。

1.2.2.3 RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化設(shè)計 參照Martins等的方法[14]并略加修改，最終反應(yīng)體系為20 μL，包括51 ngDNA模板，25 mol/L MgCl2，200 μmol/LNTP，0.5 μmol/L Primer，1.0U（5U/μL）Tap聚合酶。最佳擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，36℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用自動凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）觀察拍照。

1.2.2.4 RAPD-PCR電泳結(jié)果的記錄 通過一系列RAPD基本程序的操作后，即得到RAPD譜帶，對譜帶進(jìn)行分析。為了便于對RAPD電泳結(jié)果進(jìn)行分析，需將RAPD標(biāo)記的結(jié)果（即譜帶）轉(zhuǎn)換成數(shù)字形式。對于RAPD標(biāo)記，只記錄具有多態(tài)的譜帶，對于擴(kuò)增條帶的有或無，一般認(rèn)為強(qiáng)反應(yīng)帶和重復(fù)出現(xiàn)的弱帶應(yīng)記為“1”，而不重復(fù)出現(xiàn)的弱帶和沒有條帶的記為“0”，模糊不清或無擴(kuò)增產(chǎn)物即缺失時記錄為“-”，按此方法記錄即可得到RAPD反應(yīng)的原始數(shù)據(jù)。

1.2.2.5 分析方法 在計算機(jī)上用Gel-pro 32 analyzer軟件處理所有的RAPD產(chǎn)物電泳帶譜，把帶的有無記錄轉(zhuǎn)化為二元數(shù)據(jù)矩陣，經(jīng)NTSYS-pc（Applied Biostatistics Inc. 2.1）程序計算，得出UPGMA聚類分析結(jié)果[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試驗(yàn)材料形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

采集淳安千島湖無核柿（QD）、蘭溪大紅柿（LX）、永康方山柿（YK）、永康柿棗（YK）、天臺朱紅柿（TT）、紅朱柿砧木（TT1）、永嘉東皋柿（DG）、玉環(huán)長柿（YH），共40個單株的種實(shí)等試材，果實(shí)顏色、形狀、果核平均數(shù)見表2。

表2 果實(shí)顏色、形狀、單果果核數(shù)Table 2 Colour, shape and seeds of persimmons collected from Zhejiang province

果實(shí)顏色上，QD、LX、TT和YY顏色為橙紅色，YK和DG顏色為橙黃色；果實(shí)形狀上，QD、DG和YY形狀為長圓形，LX、YK和TT形狀類似為扁圓形；從果核來看，YH最少平均0.6個，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)個別單株基本無核或僅有1核，QD稱為“無核柿”，相對YH還是較多，平均為1.3個，YK、TT和DG平均果核數(shù)接近，分別為1.8個、1.8個和1.7個，LX平均果核最多為4.3個。

對采集的浙江優(yōu)良柿樹單株的葉長、葉寬、葉長寬比、葉柄長、果長、果寬、果長寬比、果柄長、果體積、果質(zhì)量、果密度、可溶性固形物、蛋白質(zhì)、可溶性總糖等14個性狀進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖1。

在圖1中，以1.5的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，可將供試柿樹單株劃分為2大類，即QD6、TT1和YK6為一類，其余的歸為一類。

以1.0的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，可將供試柿樹單株劃分為如下5組：

第1組：YK6；第2組：TT1；第3組：DG6；第4組：DG4、DG3、DG2、DG1；第5組：YH4、TT3、TT2、YK5、YH7、YH6、YH5、YH2、YH1、YH3、TT4 、YK2、YK4、YK3、YK1、LX4、LX3、LX5、LX2、LX1、QD5、QD3、QD4、QD2、QD7、QD1。

以0.5的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，可將供試柿樹單株劃分為17組：第1組：YK6；第2組：TT1；第3組：DG6；第4組：DG4；第5組：DG3；第6組：DG2、DG1；第7組：YH4；第8組：TT3；第9組：TT2；第10組：YK5；第11組：YH7、YH6；第12組：YH5、YH2、YH1；第13組：YH3、TT4；第14組：YK2、YK4、YK3、YK1；第15組：LX4；第16組：LX3、LX5、LX2、LX1；第17組：QD5、QD3、QD4、QD2、QD7、QD1。

圖1 浙江省柿樹各表型性狀及內(nèi)含物聚類圖Figure 1 Dendrogram by morphological traits of cultivars of D. kaki in Zhejiang

2.2 供試驗(yàn)材料RAPD鑒定結(jié)果

為了解浙江農(nóng)家柿樹供試品種/類型不同基因型之間的遺傳關(guān)系，利用RAPD相似系數(shù)矩陣按UPGMA方法進(jìn)行了聚類分析，構(gòu)建了浙江優(yōu)良農(nóng)家柿樹各單株基因型間的親緣關(guān)系樹狀圖，如圖2。

在圖2中，以0.70的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，可將40個供試柿樹單株劃分為2大類，即YK6為一類，其余的39個單株歸為一類。

以0.28的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，可將供試40個柿樹單株劃分為如下3組：YK6為一組，QD6和QD7為一組，其他為一組。

以0.20的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，可將供試40個柿樹單株劃分為如下6組：

第1組：QD1、QD2、QD3、QD4、YH1、YH2、YH3、YH4、YH6、YH7、YH5；第2組：TT1、TT2、TT3、TT4；第3組：QD6、QD7；第4組：YK1、YK5、YK2、YK3、YK4、LX1、LX2、LX3、LX4、LX5、JC1、JC3、JC6、JC5、JC2、JC4；第5組：DG1、DG2、DG4、DG5、DG6、DG3；第6組：YK6。

以0.072的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，可將供試40個柿樹單株劃分為如下11組：

第1組：QD1、QD2、QD3、QD4；第2組：YH1、YH2、YH3、YH4、YH6、YH7、YH5；第3組：TT1、TT2、TT3、TT4；第4組：QD6；第5組：QD7；第6組：YK1、YK5、YK2、YK3、YK4；第7組：LX1、LX2、LX3、LX4、LX5；第8組：JC1、JC3、JC6、JC5、JC2、JC4；第9組：DG1、DG2、DG4、DG5、DG6；第10組：DG3；第11組：YK6。

聚類結(jié)果表明，根據(jù)篩選出的16條隨機(jī)引物構(gòu)建的指紋圖譜帶型，能將40個浙江柿樹單株按其親緣關(guān)系進(jìn)行聚類，說明用這些條帶作為品種/類型鑒別的依據(jù)是可靠的。

3 結(jié)論與討論

形態(tài)學(xué)鑒定具有直觀、具體、簡單易行的特點(diǎn)，且試驗(yàn)成本較低，當(dāng)具備某些具體特異識別性狀時，可靠性高，鑒定較容易。RAPD標(biāo)記具有數(shù)量多、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定，不受栽培條件、環(huán)境變化、組織器官、發(fā)育階段影響等特點(diǎn)，具有更高的穩(wěn)定性和可靠性，且實(shí)驗(yàn)材料用量少，快速簡便。本實(shí)驗(yàn)綜合應(yīng)用形態(tài)學(xué)和RAPD技術(shù)兩種方法鑒定了浙江省優(yōu)良農(nóng)家柿樹種質(zhì)資源，結(jié)果基本一致，比較可靠。

（1）由表型性狀聚類結(jié)果可知，以1.5的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，QD6、TT1和YK6聚為一類，其余聚為一類，說明QD6、TT1和YK6親緣關(guān)系較近；而從果實(shí)顏色分析，品種/類型千島湖無核柿和天臺朱紅柿也比較接近；果核平均數(shù)上品種/類型永康方山柿和天臺朱紅柿也較接近。以1.0的相似系數(shù)值作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，供試材料劃分為5組，QD6、TT1和YK6分別單獨(dú)聚為一類，其他基本按照品種/類型聚在一起。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)QD6無論從葉形還是果形都明顯區(qū)別于千島湖無核柿的其他單株；TT1是柿本砧；YK6是柿棗，果形小如大棗、長條形與其他單株差別明顯，與聚類結(jié)果相吻合。

（2）耦合分析表型與分子RAPD-PCR鑒定結(jié)果基本吻合，QD6、TT1和YK6和其他供試材料差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其他基本按照品種/類型聚在一起。

但表型鑒定中QD6、TT1和YK6親緣關(guān)系較近的結(jié)論，在分子RAPD-PCR鑒定中沒有表現(xiàn)出來，關(guān)于對浙江柿樹種質(zhì)進(jìn)一步分類和浙江柿樹資源在全國乃至全世界所占的重要地位有待進(jìn)一步研究。

[1]胡青素，龔榜初，譚曉風(fēng)，等. 柿子的應(yīng)用價值及發(fā)展前景[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：103-106

[2]程詩明，童敏，康志雄，等. 浙江柿樹種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2014，15（3）：668-672.

[3]趙獻(xiàn)明. 浙江省農(nóng)家柿品種資源多樣性及分類研究[M]. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2012

[4]劉純杰，張兆山. 任意引物PCR及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊，2003（14）：320-323.

[5]顧萬春，王琪，游應(yīng)天，等.森林資源遺傳學(xué)概論[M]. 北京 中國科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

[6]羅正榮，米森敬三. 應(yīng)用RAPD技術(shù)研究柿品種間的親緣關(guān)系[J]. 果樹科學(xué)，1998（15）：311-316.

[7]張立平，林伯年，沈德緒. 葡萄屬RAPD分類研究[J]. 園藝學(xué)報，1998（25）：191-193.

[8]Graham J, McNicol R J, McNicol J W. A comparison of methods for the estimation of genetic diversity in strawberry cultivars[J]. Theor Appl Genet，1996，93（3）：402-406.

[9]Botta R，Akkak A，Me G, et al. Identification of pear cultivars by molecular markers[J]. ISHS Acta Hort，1998（457）：63-70.

[10]沈向，鄭學(xué)勤. 杏43個品種資源的RAPD分類[J]. 園藝學(xué)報，2000（27）：55-56.

[11]Fabbri. A, Hormaza J I, Polito V S. Random amplified polymorphic DNA analysis of olive（Olea europaea）cultivars[J]. J Am Soc Hort Sci，1995, 120（3）：538-542.

[12]程中平，陳志偉. 油桃品種的RAPD分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002（7）：63-68.

[13]劉小勇，田素忠，秦國夫，等. 提取植物和微生物DNA的SDS-CATB改進(jìn)方法[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，19（3）：100-103.

[14]Martins M，Tenreiro R，Oliveira M M. Genetic relatedness of Portuguese almond cultivars assessed by RAPD and ISSR markers[J]. Plant Cell Rep，2003（22）：71-78.

[15]Apostol B L，Black W C，Reiter P，et al. Population genetics with RAPD-PCR markers: the breeding structure of Aedes aegypti in Puerto Rico[J]. Heredity，1996，76（4）：325-334.

Identification of Cultivars of Diospyros kaki in Zhejiang by Phenotypic Characters and RADP

CHENG Shi-ming1，TONG Min2，LIANG Jun-ying1，YING Shang-jiao3，KANG Zhi-xiong4，HU Zhen-ming5，CHEN You-wu1，YE Chang-fei6

（1. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 2. Haining Forestry Station of Zhejiang, Haining 314400, China; 3. Yongkang Forestry Bureau of Zhejiang, Yongkang 321300, China; 4. Zhejiang Forestry Departmen, Hangzhou 310020, China; 5. Yongkang Zhoushan Township Government of Zhejiang, Yongkang 321300, China; 6. Yunhe Forestry Bureau of Zhejiang, Yunhe 323600, China）

40 Diospyros kaki trees of 9 cultivars were selected in Zhejiang province for analyzing their genetic relationship by phenotypic character and RAPD. Cluster analysis on phenotypic characters resulted that 9 cultivars could be divided into two groups when similarity coefficient was 1.5. UPGMA on similarity coefficient matrix of RAPD had similar result with cluster analysis.

Diospyros kaki; germplasm resources; phenotypic diversity; RAPD

S718.46

A

1001-3776（2015）04-0013-05

2015-02-21；

：2015-06-25

浙江省果品農(nóng)業(yè)新品質(zhì)選育重點(diǎn)項(xiàng)目（2012C12904-10）；浙江省科研院所專項(xiàng)（2012F-20012）；浙江省森林食品研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2011F10069）；2014年度國家林木（含竹藤花卉）種質(zhì)資源平臺浙江分平臺

程詩明（1975-），男，安徽安慶人，副研究員，博士，從事林木遺傳育種研究；*通訊作者。