不同劑量沙美特羅替卡松聯(lián)合川芎嗪對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺組織炎癥的影響

不同劑量沙美特羅替卡松聯(lián)合川芎嗪對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺組織炎癥的影響

金明哲熊瑛1

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶402160)

摘要〔〕目的 探討ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺部炎癥的干預(yù)作用。方法70只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、川芎嗪組(C組)、中劑量ICS/LABA組(D組)、中劑量ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪組(E組)、高劑量ICS/LABA組(F組)、高劑量ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪組(G組)，每組10只。采用煙熏加氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)法建立COPD模型。吸入ICS/LABA中、高2個(gè)劑量及川芎嗪腹腔注射進(jìn)行干預(yù)。觀察大鼠肺功能及肺組織病理變化，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定血中CD4、CD8值，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定肺泡灌洗液(BALF)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)，免疫組化法測(cè)定肺組織中金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制物(SLPI)的表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)肺組織中MMP-9 mRNA的表達(dá)。結(jié)果B組大鼠肺泡壁破壞，肺大皰形成，間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，符合COPD肺組織病理改變，各干預(yù)組均有所減輕；B組大鼠MMP-9及其mRNA相對(duì)含量、TGF-β1濃度比A組大鼠顯著升高；CD4/CD8比A組大鼠明顯降低。經(jīng)ICS/LABA及川芎嗪干預(yù)后，各組大鼠MMP-9及其mRNA相對(duì)含量、TGF-β1濃度與B組大鼠相比有明顯降低(P<0.05)；CD4/CD8、SLPI比B組大鼠有顯著提高(P<0.05)，以G組療效最明顯(P<0.05)。相關(guān)分析表明，MMP-9與第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)/用力肺活量(FVC)呈負(fù)相關(guān)(r=0.861 3，P<0.01)；SLPI與FEV0.3/FVC呈正相關(guān)(r=0.832 1，P<0.01)。結(jié)論ICS/LABA和川芎嗪均可抑制COPD大鼠肺部炎癥，高劑量ICS優(yōu)于低劑量ICS，且聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥療效顯著，其機(jī)制可能是通過降低TGF-β1、MMP-9水平并調(diào)節(jié)SLPI及CD4、CD8的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞〔〕阻塞性肺疾?。晦D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；金屬基質(zhì)蛋白酶9；分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制物

中圖分類號(hào)〔〕R563.3〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：熊瑛(1954-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事哮喘及慢性阻塞性肺疾病研究。

1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科

第一作者：金明哲(1988-)，男，碩士，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是嚴(yán)重影響人類健康的多發(fā)病之一，炎癥是其發(fā)病的核心機(jī)制，香煙及感染等有害刺激導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞在氣道局部聚集，促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)等炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，并構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)〔1〕，使肺部大量炎癥細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)；并降低機(jī)體免疫能力及分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)的表達(dá)，使肺組織損傷與修復(fù)交替出現(xiàn)，最終引起肺組織破壞及纖維化。GOLD建議以高劑量吸入性糖皮質(zhì)激素(ICS)聯(lián)合長(zhǎng)效B2受體激動(dòng)劑(LABA)為最佳方案，但長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用ICS副作用大，炎癥控制不理想。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，川芎嗪能抑制肺部炎性細(xì)胞的聚集、氧自由基的釋放，并可促進(jìn)炎癥吸收，減輕肺部損害。ICS/LABA聯(lián)用川芎嗪對(duì)COPD肺部炎癥是否具有更好的調(diào)控作用，目前這方面的實(shí)驗(yàn)研究還未見報(bào)道。本研究觀察不同劑量的ICS/LABA及聯(lián)用川芎嗪對(duì)COPD大鼠肺功能、肺組織中TGF-β1、MMP-9、SLPI及CD4/CD8表達(dá)改變，初步探討其對(duì)COPD動(dòng)物模型肺部炎癥的調(diào)控作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物模型復(fù)制SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠70只，平均體重(160±20)g(重慶鑫騰生物公司)。隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、川芎嗪組(C組)、中劑量ICS/LABA組(D組)、中劑量ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪組(E組)、高劑量ICS/LABA組(F組)、高劑量ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪組(G組)，每組10只。天下秀牌香煙(川渝中煙工業(yè)有限公司，焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.8 mg)；LPS(美國，Sigma公司)；TGF-β1試劑盒(美國R&D公司)；ICS/LABA(舒利迭50 μg/250 μg、50 μg/500 μg，葛蘭素史克公司)；川芎嗪注射液(河南輔仁懷慶堂制藥有限公司)；動(dòng)物肺功能儀(美國 Buxco公司)；SLPI抗體(美國 Bioworld Technology公司)；MMP-9抗體(北京博奧森公司)；Trizol RNA 提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (美國MBI公司)。參照文獻(xiàn)〔3，4〕等所用方法復(fù)制動(dòng)物模型，有所改良：B組大鼠在實(shí)驗(yàn)第1、14天，向氣管內(nèi)注入LPS(200 μg/200 μl)。分別在實(shí)驗(yàn)第2～13天、第15～45天，將大鼠放入容積為60 L的自制密閉玻璃染毒箱(30 cm×40 cm×50 cm)內(nèi)被動(dòng)吸煙，方法為：將點(diǎn)燃的香煙通過玻璃孔將煙霧注入煙熏箱內(nèi)，2次/d，每次15支，持續(xù)1 h，間隔4 h/組。各干預(yù)組造模方法同B組，于第16～45天煙熏前1 h開始干預(yù)，1次/d；C組以川芎嗪腹腔注射(80 mg/kg)；D組以舒利迭(50 μg/250 μg)滴鼻；E組以川芎嗪(80 mg/kg)腹腔注射、舒利迭(50 μg/250 μg)滴鼻；F組以舒利迭(50 μg/500 μg)滴鼻；G組以川芎嗪(80 mg/kg)腹腔注射、舒利迭(50 μg/500 μg)滴鼻；各組滴鼻方法為，舒利迭兩噴溶于1.7 ml生理鹽水+0.3 ml聚山梨酯-80，0.3 ml/只，2次/d，據(jù)文獻(xiàn)〔5〕，此劑量和成人每天1 mg相符；A組：各干預(yù)因素均以相同劑量生理鹽水代替，玻璃箱內(nèi)吸入空氣。

1.2大鼠肺功能測(cè)定實(shí)驗(yàn)第46天，以2%的戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉大鼠，氣管插管，放入體描箱，應(yīng)用動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀〔6〕，測(cè)定呼氣峰流量(PEF)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)、FEV0.3/用力肺活量(FVC)。

1.3CD4、CD8數(shù)值的檢測(cè)剪開大鼠腹壁皮膚，暴露腹主動(dòng)脈，以無菌采血器穿刺腹主動(dòng)脈取血2 ml，裝入4 ml BD抗凝管內(nèi)。搖勻后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血中CD4、CD8值。

1.4肺泡灌洗液(BALF)TGF-β1的檢測(cè)以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行右心室灌注，打開胸腔后夾閉右肺，以3 ml生理鹽水灌洗左肺，反復(fù)3次，總回收量約為7 ml，回收率為75%~80%。所回收的BALF采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)TGF-β1濃度，按照說明書操作。

1.5肺組織標(biāo)本和形態(tài)定量分析取右肺中葉，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色；取右肺上葉，修剪成0.5 cm厚的塊狀，生理鹽水沖洗兩遍后，迅速放于液氮中。肺組織用2%四氧化鋨固定，切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛電子染色，應(yīng)用圖像處理系統(tǒng)，測(cè)量肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)、肺泡破壞指數(shù)(DI)。

1.6肺組織SLPI和MMP-9檢測(cè)采用10%多聚甲醛固定各組大鼠右肺中葉，石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水，按MMP-9、SLPI免疫組化檢測(cè)試劑盒說明書操作，抗體濃度均為1∶100。每只大鼠取2張切片，應(yīng)用HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)每張切片10個(gè)視野的陽性系數(shù)。陽性系數(shù)的計(jì)算參見文獻(xiàn)〔7〕。

1.7RT-PCR法測(cè)定大鼠肺組織MMP-9 mRNA表達(dá)取肺組織標(biāo)本30 mg，按照Trizol RNA提取試劑盒說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以SYBR Green Ⅰ作為熒光標(biāo)志物，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)GenBank的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以β-actin為內(nèi)參照物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。MMP-9正義引物：5'-CATCTGGGGATTGAACTCAG-3',反義引物：5'-GTGGTGTCCTCCGATGTAAG-3',擴(kuò)增長(zhǎng)度為235 bp。β-actin正義引物：5'-CCTAGACTTCGAGCAAGAGA-3',反義引物：5'-AGAGGTCTTTACGGATGTCA-3',擴(kuò)增長(zhǎng)度為221 bp。通過融解曲線和電泳結(jié)果確定目的條帶并分析，△△Ct法進(jìn)行目的基因的相對(duì)定量。

2結(jié)果

2.1一般情況及組織病理學(xué)觀察B組大鼠均精神萎靡，少食，體毛干枯發(fā)黃，咳嗽及呼吸急促、口唇及四肢發(fā)紺、仰臥位呼吸，各干預(yù)組有不同程度好轉(zhuǎn)，制作模型時(shí)共死亡10只。光鏡下，A組肺組織無異常改變；B組大鼠各級(jí)支氣管明顯狹窄，氣道上皮復(fù)層化，杯狀上皮細(xì)胞增生，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁破壞，肺泡腔擴(kuò)大，部分破裂融合成肺大皰。干預(yù)組肺泡壁破壞程度和肺大皰數(shù)目較B組均有所減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見圖1。

2.2大鼠肺功能與肺組織形態(tài)學(xué)結(jié)果與A組相比，B組大鼠PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC顯著降低，MLI和DI明顯增高(P<0.05)。各干預(yù)組大鼠PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC均明顯高于B組，MLI和DI顯著低于B組(均P<0.05)；干預(yù)組組間比較，G組變化明顯P<0.05)。見表1。

2.3大鼠血清CD4/CD8比較B組大鼠血清CD4/CD8的含量明顯低于A組(P<0.05)；各干預(yù)組CD4/CD8值明顯高于B組(P<0.05)。干預(yù)組組間比較，G組變化明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1　各組大鼠肺組織光鏡下形態(tài)觀察(HE，×100)

2.4BALF中TGF-β1表達(dá)水平B組TGF-β1濃度明顯高于A組(P<0.05)；各干預(yù)組TGF-β1濃度明顯低于B組(P<0.05)；干預(yù)組組間比較，G組變化明顯(P<0.05)。見表2。

2.5SLPI在大鼠肺組織的免疫組化表達(dá)SLPI在氣管、支氣管上皮細(xì)胞免疫染色呈強(qiáng)陽性，僅在細(xì)胞質(zhì)和管腔側(cè)細(xì)胞膜著色(圖2)。A組SLPI呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)；B組為弱陽性表達(dá)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各干預(yù)組與B組相比，SLPI表達(dá)明顯增強(qiáng)，各組陽性系數(shù)與B組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組組間比較，G組變化明顯(P<0.05)。見表2。

表1　大鼠肺功能與形態(tài)分析比較 ± s)

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05；與G組比較：3)P<0.05；下表同

表2　大鼠血清CD4/CD8、BALF中TGF-β 1濃度、肺組織SLPI、MMP-9陽性系數(shù)及MMP-9 mRNA 相對(duì)含量的比較

圖2　各組大鼠SLPI的表達(dá)(DAB，×400)

2.6MMP-9在大鼠肺組織的免疫組化表達(dá)MMP-9在支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、等免疫染色呈強(qiáng)陽性，以胞質(zhì)染色為主(圖3)。B組MMP-9強(qiáng)陽性表達(dá)；A組表達(dá)MMP-9呈弱陽性表達(dá)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各干預(yù)組MMP-9呈中度陽性表達(dá)，與B組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組組間比較，G組變化明顯(P<0.05)。見表2。

圖3　各組大鼠MMP-9的表達(dá)(DAB，×400)

2.7大鼠肺組織中MMP-9 mRNA的表達(dá)與A組比較，B組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA表達(dá)量明顯增高(P<0.05)；各干預(yù)組大鼠支氣管肺組織中MMP-9 mRNA表達(dá)量明顯比B組降低(P<0.05)；干預(yù)組組間比較，G組變化明顯(P<0.05)。見表2。

3討論

吸煙和反復(fù)呼吸道感染等導(dǎo)致的炎性介質(zhì)與細(xì)胞因子瀑布可直接損傷氣道和肺組織，促使蛋白酶/抗蛋白酶、氧化/抗氧化失衡，從而使COPD氣道炎癥遷延不愈。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、口唇及四肢發(fā)紺，肺功能FEV0.3/FVC明顯降低，光鏡下肺組織出現(xiàn)明顯炎癥浸潤(rùn)、肺泡間隔斷裂、肺泡腔擴(kuò)大、部分融合為肺大皰，MLI和DI顯著增加，說明動(dòng)物模型復(fù)制成功〔8〕。

COPD是一種慢性炎癥性疾病，TGF-β1在其發(fā)病中起著重要作用，不僅促使成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加纖維黏蛋白和膠原的合成，并抑制膠原酶和蛋白酶的產(chǎn)生以減少膠原降解，導(dǎo)致氣道炎癥及纖維化，同時(shí)作為強(qiáng)效免疫抑制因子〔9〕，能抑制T/B淋巴細(xì)胞的增殖及免疫球蛋白的分泌，降低免疫水平，加重肺組織炎癥；此外TGF-β1可通過活化細(xì)胞內(nèi)真核蛋白激酶信號(hào)途徑和上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Ets-1刺激足突細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)增加，MMP-9作為蛋白水解酶，可破壞肺泡基質(zhì)成分，促使大量炎性細(xì)胞穿透基底膜屏障進(jìn)入肺組織，釋放炎性因子，加重蛋白酶/抗蛋白酶失衡，使肺部炎癥呈聯(lián)級(jí)式爆發(fā)；同時(shí)TGF-β1還通過Smads信號(hào)通路抑制SLPI的表達(dá)和分泌〔10〕，SLPI作為氣道內(nèi)最重要的保護(hù)基質(zhì)，具有抗蛋白酶、抗炎、抗真菌活性，可抑制MMP-9的產(chǎn)生，減輕氣道炎癥；還能降低氣道中彈性蛋白酶水平，進(jìn)而中斷炎癥循環(huán)；研究發(fā)現(xiàn)〔11〕,無論在急性發(fā)作期還是穩(wěn)定期，COPD患者肺泡灌洗液中CD4/CD8水平都呈下降狀態(tài)，導(dǎo)致免疫功能低下，進(jìn)而加重COPD肺部炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果與相關(guān)報(bào)道相一致〔12〕，提示炎性細(xì)胞因子在COPD肺部炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

舒利迭是丙酸氟替卡松和沙美特羅的復(fù)方制劑，分別作用于氣道炎癥的不同環(huán)節(jié)，可抑制多種炎性細(xì)胞的活化及炎性因子的生成；并能增強(qiáng)纖毛的清除能力，減輕氣道高反應(yīng)性。在某些環(huán)節(jié)上更具有協(xié)同作用，ICS能減少β2受體的脫敏和耐藥性;而LABA可將糖皮質(zhì)激素受體磷酸化,使受體對(duì)類固醇的刺激更敏感,進(jìn)而增強(qiáng)抗炎效能。而川芎嗪可減輕氣道黏膜水腫，利于分泌物排出；能降低肺動(dòng)脈壓和肺毛細(xì)血管內(nèi)壓，減輕右心后負(fù)荷，改善機(jī)體缺氧狀態(tài)；還可提高超氧化物歧化酶含量，增強(qiáng)清除自由基的作用；同時(shí)可阻止免疫復(fù)合物的形成，抑制病原菌生長(zhǎng)，促進(jìn)炎癥吸收。

本研究結(jié)果說明在抑制COPD肺部炎癥方面，ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪的療效優(yōu)于單一用藥，對(duì)減少肺組織的破壞，改善肺功能，調(diào)節(jié)肺部TGF-β1、MMP-9、SLPI的表達(dá)和分泌及增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等方面均有較滿意的效果，這就提示，不管在COPD急性發(fā)作應(yīng)用高劑量ICS/LABA，還是穩(wěn)定期降階梯應(yīng)用中劑量ICS/LABA時(shí)，均可聯(lián)合應(yīng)用川芎嗪治療，對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫、保護(hù)肺功能、減少急性發(fā)作頻率和入院率，延緩COPD的發(fā)展可能具有更好的效果。

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〔2013-09-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

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