MMP-13在黏液性和非黏液性大腸癌組織中的表達(dá)差異

MMP-13在黏液性和非黏液性大腸癌組織中的表達(dá)差異

霍思博張凱諶通李春生劉銅軍

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，吉林長春130033)

摘要〔〕目的探討在黏液性和非黏液性大腸癌(CRC)中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13和病理學(xué)表達(dá)的臨床意義。方法采用組織芯片技術(shù)及免疫組化方法檢測(cè)180例CRC組織(含黏液性和非黏液性大腸癌各90例)中MMP-13的表達(dá)情況，采用χ2檢驗(yàn)分析黏液性和非黏液性CRC患者各臨床病理學(xué)特征及其與MMP-13表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果與非黏液性大腸癌相比，黏液性大腸癌與年齡、侵襲度深、淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移率和瘤周及瘤內(nèi)的中性粒細(xì)胞浸潤顯著相關(guān)，但與性別、腫瘤大小、腫瘤位置及腫瘤的生長形態(tài)并無明顯的相關(guān)關(guān)系。在非黏液性CRC的MMP-13陽性表達(dá)率顯著高于黏液性CRC。大多數(shù)的黏液性CRC不表達(dá)或僅弱表達(dá)MMP-13，但其腫瘤侵襲深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率卻顯著高于非黏液性CRC。結(jié)論在對(duì)CRC的靶向治療中，針對(duì)MMP-13的靶向治療對(duì)非黏液性CRC比對(duì)黏液性大腸癌更有效。

關(guān)鍵詞〔〕基質(zhì)金屬蛋白酶-13；黏液性大腸癌；非黏液性大腸癌；組織芯片

中圖分類號(hào)〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳青年基金(201101048)

通訊作者：劉銅軍(1962-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事可生物降解材料的臨床應(yīng)用及大腸癌的基礎(chǔ)與臨床研究。

第一作者：霍思博(1987-)，男，碩士,主要從事可生物降解材料的臨床應(yīng)用及大腸癌的基礎(chǔ)與臨床研究。

黏液性大腸癌(CRC)(包括黏液腺癌和印戒腺癌)是一類特殊的CRC組織學(xué)類型，其特征是黏液成分占腫瘤的50%以上?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和新生血管形成過程中具有十分重要的促進(jìn)作用〔1〕，而MMP-13(膠原酶3)位于MMP活化級(jí)聯(lián)中的中心位置，通過激活MMP-2和MMP-9以及被MMP-2、MMP-3和MT1-MMP (膜型MMP-1)激活發(fā)揮作用〔2〕。MMP-13在多種癌癥中均有表達(dá)〔3〕，最早發(fā)現(xiàn)于人乳腺癌組織中〔3〕。但已有的文獻(xiàn)證明，CRC組織中表達(dá)多種MMP〔4〕，目前少有文獻(xiàn)報(bào)道MMP-13在CRC中的表達(dá)情況，尤其是MMP-13在黏液性CRC中的表達(dá)及其對(duì)分子靶向治療的意義。本研究擬通過免疫組化方法檢測(cè)含CRC標(biāo)本的組織芯片(TMA)中MMP-13在黏液和非黏液型CRC中的表達(dá)差異，探討MMP-13對(duì)CRC診斷及治療中的意義。

1材料與方法

1.1一般材料收集2011年8月至2013年10月我院CRC手術(shù)患者癌組織標(biāo)本180例，其中包括90例黏液性CRC(含68例黏液成分占腫瘤50%以上的黏液性腺癌和22例印戒細(xì)胞癌)和90例非黏液性CRC(含56例普通腺癌和34例黏液成分<50%的腺癌)，所有組織均由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師再次進(jìn)行組織學(xué)確診。對(duì)腫瘤的組織學(xué)特征進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括淋巴管栓塞、周圍神經(jīng)浸潤、腺瘤頂部出現(xiàn)腫瘤、與血吸蟲病相關(guān)、腫瘤邊緣、瘤周及瘤內(nèi)的中性粒細(xì)胞。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行過任何放化療治療。研究獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2組織芯片制作組織芯片的制作方法參照改良的鉛筆尖技術(shù)〔5〕。每例樣本同時(shí)點(diǎn)取3個(gè)0.8 mm直徑的有代表性的組織用于制作組織芯片。制作成的組織芯片蠟塊進(jìn)行組織切片，切成4 μm厚的切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木精和伊紅(HE)染色，其他切片貼在經(jīng)硅化玻片試劑盒(APES)包被的玻片上，用于免疫組化染色。

1.3免疫組化染色組織芯片切片常規(guī)脫蠟至水后，用0.3%H2O2(甲醇配制)處理30 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶，然后將切片置于乙二胺四乙酸(EDTA)修復(fù)液(pH8.0)中進(jìn)行微波熱修復(fù)30 min，自然冷卻后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，3 min/次。滴加小鼠抗人MMP-13單克隆抗體(1∶500稀釋，Abcam公司)，4℃孵育過夜。取出后，PBS洗滌3次，3 min/次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(MaxVisionTM plus試劑盒，福州邁新生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育20 min后，PBS洗滌3次，3 min/次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精負(fù)染，中性樹膠封片后，光鏡下觀察陽性結(jié)果。

1.4免疫組化結(jié)果判定組化結(jié)果判定采用半定量方法。MMP-13陽性為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕色或棕黃色著色，按胞質(zhì)著色強(qiáng)度分為陰性(-，0分)、弱陽性(+，1分)、陽性(，2分)和強(qiáng)陽性(，3分)；每個(gè)組織點(diǎn)中的細(xì)胞陽性率同樣分為4級(jí)：0為陽性細(xì)胞率<5%，1為陽性率6%~25%，2為陽性率26%~50%，4為陽性率>50%。每個(gè)組織點(diǎn)的最后得分為陽性強(qiáng)度乘以陽性率，三點(diǎn)的平均分為該樣本的最后得分。為了便于分析，將腫瘤劃分為陰性組(得分為0)、低表達(dá)組(得分<3)和高表達(dá)組(得分≥3)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，組間的臨床病理學(xué)資料分析和組織學(xué)特性分析采用χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1臨床病理學(xué)特征比較黏液性與非黏液性大腸癌相比，年齡明顯年輕、浸潤程度加深和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多(P=0.017、0.008、0.008)，但與性別、腫瘤大小、TNM分期、腫瘤位置和腫瘤的生長形態(tài)無明顯的相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。見表1。

2.2兩組組織學(xué)特性比較黏液性CRC的癌周及瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤明顯少于非黏液性組(P<0.001)，但其他的組織學(xué)特性在兩組間并無明顯差異(P>0.05)。見表2。

2.3MMP-13在CRC組織中的表達(dá)MMP-13陽性染色主要定位于腫瘤細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)(見圖1)。在非黏液性CRC組織中，有65.5%的標(biāo)本為MMP-13高表達(dá)，而在黏液性CRC標(biāo)本中僅有16.7%表現(xiàn)為MMP-13高表達(dá)，二組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見表2)。以普通腺癌作為參照組，對(duì)4個(gè)組織學(xué)亞型的MMP-13表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示，普通腺癌中MMP-13的表達(dá)顯著高于腺癌伴黏液成分小于腫瘤的50%的腺癌(P=0.001)、黏液腺癌(P<0.001)和印戒細(xì)胞癌(P<0.001，表3)。約有82%黏液腺癌和90%的印戒細(xì)胞癌呈MMP-13陰性或低表達(dá)。非黏液癌組織的MMP-13表達(dá)并未均勻分布，呈明顯的不均一性(見圖1)，而在黏液性癌中，其MMP-13表達(dá)則較為均勻(見圖2)。

表1　患者的臨床病理學(xué)特征〔 n(%), n=90〕

表2　180例CRC標(biāo)本的組織學(xué)特性〔 n(%), n=90〕

A.腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)強(qiáng)陽性均勻表達(dá)(×200)；B.腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)不均勻表達(dá)(×200)；C.腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)中等均勻表達(dá)(×200)；D.腫瘤細(xì)胞陰性而基質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞呈陽性(×400) 圖1　MMP-13在普通腺癌中的表達(dá)

A.黏液性腺癌組織中均勻的胞質(zhì)內(nèi)弱表達(dá)；B.黏液性腺癌中MMP-13表達(dá)陰性；C.印戒細(xì)胞癌中等胞質(zhì)內(nèi)著色；D.印戒細(xì)胞癌中陰性表達(dá) 圖2　MMP-13在黏液性大腸癌中的表達(dá)

組織學(xué)類型陰性低表達(dá)高表達(dá)χ2值P值普通腺癌1(1.8)11(19.6)44(78.6)--黏液成分低于腫瘤50%的腺癌8(23.5)11(32.4)15(44.1)13.2910.001黏液腺癌27(39.7)29(42.6)12(17.7)41.028<0.001印戒細(xì)胞癌10(45.5)9(40.9)3(13.6)31.714<0.001

3討論

基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的重要屏障，而MMPs是ECM降解過程中最重要的酶類之一，在腫瘤的播散與轉(zhuǎn)移中起重要作用。MMP-13是MMPs的一種，可激活其他亞型的MMPs，也能被多種MMPs所激活。研究表明，MMP-13表達(dá)的上調(diào)是其他MMP分子活化作用的結(jié)果，主要作用于催化ECM的破壞，包括降解Ⅰ~Ⅳ型膠原纖維、黏連蛋白、蛋白多糖等物質(zhì)，在骨骼發(fā)育、關(guān)節(jié)軟骨和滑膜發(fā)育以及皮膚創(chuàng)傷修復(fù)等生理學(xué)過程中起重要作用〔4〕。MMP-13在多種人類疾病中表達(dá)上調(diào)，因此，被認(rèn)為是一種重要的治療靶標(biāo)。近年來，在人類腫瘤中，也發(fā)現(xiàn)有MMP-13表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。危蕾等〔5〕的研究表明，MMP-13 mRNA在骨巨細(xì)胞瘤中顯著高表達(dá)，且與其預(yù)后密切相關(guān)?；谏鲜鲈?，有理由推論，MMP-13可能是評(píng)估CRC患者的腫瘤生物學(xué)行為及其預(yù)后的一個(gè)重要臨床指標(biāo)。然而目前于MMP-9和MMP-2與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)的研究較多，但關(guān)于MMP-13在CRC中作用的研究報(bào)道較少。

本研究結(jié)果與Numata等〔6〕的研究結(jié)果一致。本研究提示對(duì)于黏液性CRC轉(zhuǎn)移和浸潤的過程中可能有更為重要的原因，但目前尚不完全清楚，部分原因認(rèn)為可能是腫瘤內(nèi)部在壓力下出現(xiàn)了分解和擴(kuò)散，使得黏液性CRC細(xì)胞可以進(jìn)入腹腔和淋巴系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散到局部淋巴結(jié)〔7〕。但也有人發(fā)現(xiàn)，合成和分泌大量黏蛋白的腫瘤細(xì)胞系具有更強(qiáng)的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移傾向〔8〕。與這些研究結(jié)果一致，黏液癌細(xì)胞可能并不需要MMP-13或其他的MMP分子介導(dǎo)的ECM破壞，以利于腫瘤的侵襲。

據(jù)報(bào)道〔9〕，在乳腺癌和惡性黑色素瘤等惡性腫瘤中，MMP-13的表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)而不是基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，但在頭頸部腫瘤中，MMP-13在腫瘤細(xì)胞及周圍的基質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)〔10〕。盡管腫瘤細(xì)胞本身可以突破多種組織障礙進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但MMP-13在成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞中的表達(dá)與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)升高密切相關(guān)〔11〕。本研究中，可能是由于MMP-13和其他MMP分子的上調(diào)是在需要的部位在特定的時(shí)刻合成的〔12〕，在非黏液性CRC中MMP是腫瘤細(xì)胞侵襲所必需的，因而表達(dá)為灶性，在腫瘤邊緣的浸潤區(qū)最強(qiáng)，而在中心部位較弱，該結(jié)果不僅說明腺癌具有分泌大量MMP-13的功能，而且與腺癌浸潤的生物學(xué)特性相符，而在黏液性CRC轉(zhuǎn)移的過程中卻并不需要MMP-13參與，所以產(chǎn)生了這種病理表現(xiàn)，具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。研究〔13〕證明，炎癥在腫瘤的進(jìn)展過程中起重要作用，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞是實(shí)體瘤瘤周及瘤內(nèi)白細(xì)胞浸潤的主要類型。這一過程與機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)有關(guān)。在腫瘤邊緣區(qū)域內(nèi)，MMPs主要來源于活化的基質(zhì)細(xì)胞和炎性白細(xì)胞。所以本文也強(qiáng)調(diào)了黏液性CRC的發(fā)生、發(fā)展和侵襲過程可能并不需要這些細(xì)胞和分子參與，同時(shí)也說明機(jī)體對(duì)黏液性的反應(yīng)較弱，其病理變化與腺癌有本質(zhì)的區(qū)別。但近期的一項(xiàng)研究〔14〕表明，曼氏血吸蟲相關(guān)的CRC具有獨(dú)特的病理學(xué)特征，包括高比例的多中心腫瘤和黏液型。在本研究中，與血吸蟲病變相關(guān)的結(jié)腸癌的比例僅為15.3%(結(jié)果未列出)，明顯低于由張宏等〔15〕報(bào)道的發(fā)病頻率，這可能與中國的衛(wèi)生條件逐步提高有關(guān)。

綜上所述，黏液性癌的侵襲可能主要取決于黏蛋白的解離，而不是MMP-13。因此，認(rèn)為在CRC治療中，針對(duì)MMP-13的靶向治療對(duì)非黏液性CRC比黏液性CRC更為有效。這項(xiàng)化驗(yàn)將有利于靶向治療特定對(duì)象的選擇，也為CRC的治療提供了一個(gè)新的思路。

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〔2014-01-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)