N-乙酰半胱氨酸對單側(cè)腎積水大鼠造影劑腎損害的保護(hù)作用

N-乙酰半胱氨酸對單側(cè)腎積水大鼠造影劑腎損害的保護(hù)作用

夏強(qiáng)劉春曉鐘志勇1鄭俠1

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510280)

摘要〔〕目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)對單側(cè)腎積水大鼠造影劑腎損害的保護(hù)作用。方法雄性SD大鼠64只，制備可復(fù)性完全性左側(cè)輸尿管梗阻動物模型，模型成熟后隨機(jī)分為3組，NAC組，生理鹽水(NS)組與模型對照組。3 d后NAC組和NS組大鼠注射造影劑，模型對照組注射等量生理鹽水，注射藥物1 d后，各組取半數(shù)大鼠處死取材檢測腎臟形態(tài)學(xué)變化、血清中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、腎小管細(xì)胞凋亡率及腎組織Bcl-2 mRNA表達(dá)；剩余大鼠手術(shù)解除輸尿管梗阻，3 w后處死，同樣作上述項目檢測。結(jié)果注射造影劑的NAC組和NS組用藥后第1天，大鼠腎臟體積、腎實質(zhì)厚度和重量差異顯著(P<0.05)，血清NGAL均較模型對照組顯著升高(P<0.05)，NAC組較NS組NGAL水平顯著降低(P<0.05)，三組左腎小管細(xì)胞凋亡率及Bcl-2 mRNA表達(dá)比較無顯著性差異(P>0.05)；解除梗阻后3 w，各組NGAL水平較前均無顯著性變化(P>0.05)；NAC組左腎小管細(xì)胞凋亡率及Bcl-2 mRNA表達(dá)均高于模型對照組，但低于NS組(P<0.05)。結(jié)論NAC對單側(cè)腎積水大鼠造影劑引起的腎損害的具有一定的保護(hù)作用，可能是通過上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)抑制腎小管細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞〔〕N-乙酰半胱氨酸；腎積水；造影劑；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；凋亡

中圖分類號〔〕R981.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：劉春曉(1957-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事微創(chuàng)泌尿外科疾病研究。

1廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心比較醫(yī)學(xué)實驗室

第一作者：夏強(qiáng)(1971-)，男，主任醫(yī)師，博士在讀，主要從事微創(chuàng)泌尿外科疾病研究。

在腎臟功能正常的個體中，應(yīng)用造影劑后，有相當(dāng)比例者發(fā)生造影劑急性腎損害(CI-AKI)或造影劑腎病(CIN)〔1，2〕，對于綜合腎功能減退者，發(fā)生比例更高〔3，4〕。單側(cè)梗阻性腎積水可引起單側(cè)腎功能減退〔5〕，而造影劑的應(yīng)用更容易對功能受損的積水腎產(chǎn)生損害；國內(nèi)外許多學(xué)者的研究已經(jīng)證實，N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為抗氧化劑對冠脈造影和冠脈介入治療過程中造影劑腎損害有顯著的保護(hù)作用〔6，7〕，但它對于單側(cè)輸尿管完全梗阻時造影劑腎損害的影響未見報道。本研究探討NAC對單側(cè)腎積水大鼠造影劑腎損害的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性SPF級SD大鼠64只，體重250～290 g(由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，0113875)。自由進(jìn)食和飲水，顆粒飼料和飲用水為廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

1.2實驗用品及藥物DP70倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國LEICA公司，RM2135)，生物組織全自動脫水機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 TS-12C)，生物組織包埋機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司，BM-VII)，生物組織全自動染色機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司，RS-18)，病理圖像分析系統(tǒng)(日本奧林巴斯，BX41)。NAC(意大利贊邦集團(tuán)Zanbon，H20090620)；碘海醇注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，H10970326)。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)測定試劑盒，TUNEL試劑盒(Roche公司，12156792910)，胰蛋白酶(博士德生物技術(shù)有限公司)；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Total RNA提取試劑盒(均購于TaKaRa公司)。

1.3模型制作及分組〔8〕64只大鼠適應(yīng)性實驗1 w，術(shù)前12 h禁食、不禁水；腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，腹部正中剃毛、消毒、切開，暴露左側(cè)腎盂輸尿管連接部(UPJ)。在UPJ下方1 cm處游離一段長約5 mm的輸尿管，將長1.8 cm的硬膜外麻醉用塑料導(dǎo)管對折成V型，輕輕套卡在輸尿管上，用1號絲線結(jié)扎V管兩端令輸尿管管腔夾閉，注意線結(jié)與末端之間僅保留1~2 mm的距離。假手術(shù)組只游離輸尿管不夾閉。術(shù)后取右側(cè)臥位，單籠飼養(yǎng)，肌注青霉素鈉8×104U/只預(yù)防感染，連續(xù)3 d；同條件飼養(yǎng)3 w。造模3 w后，SPF級SD大鼠64只，備可復(fù)性完全性左側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型，模型成熟后隨機(jī)分為3組，NAC組24只，用NAC灌胃3 d(300 mg·kg-1·d-1)；生理鹽水灌胃組(NS組)20只，用NS灌胃3 d；模型對照組20只，不灌胃，同條件飼養(yǎng)3 d。

1.4用藥及檢測建模3 d后，NAC組和NS組模型大鼠經(jīng)尾靜脈注射造影劑(3 000 mg/kg)，模型對照組不用造影劑，注射等量NS。注射藥物1 d后，各組取半數(shù)大鼠麻醉下腹主動脈采血2 ml，4℃ 3 000 r/min離心10 min，取血清測定NGAL，采血后頸椎脫臼處死大鼠取雙腎，檢測腎臟的長、寬、高，計算腎臟體積，公式：體積=(長×寬×高)×0.523；腎臟沿背側(cè)縱軸剖開放盡積水，吸水紙蘸干后稱重；腎實質(zhì)厚度(最厚和最薄平均值)，并采用Tunnel法檢測腎臟組織的細(xì)胞凋亡。

1.5RT-PCR檢測細(xì)胞Bcl-2 mRNA的表達(dá)Trizol試劑提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用 Primer 5.0設(shè)計引物。Bcl-2上游引物：5′-CCCTGGCATCTTCTCCTTC-3′，下游引物5′-GGGTGACATCTCCCTGTTGA-3′；內(nèi)參基因β-actin上游引物：5′-CCCTCTTTTGTGCCTTGATAGTTCG-3′，下游引物5′-GGAGTCCTTCTGACCCATAC-3′。PCR擴(kuò)增后，取5 μl PCR產(chǎn)物在含溴乙啶的1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，利用Gel Pro 4.0軟件計算基因表達(dá)條帶灰度值。被檢測的目的基因mRNA的表達(dá)水平用A目的基因/A內(nèi)參基因表示。

1.6解除梗阻剩余大鼠麻醉后再次開腹，暴露梗阻部位，找到V管，剪開結(jié)扎線，解除梗阻，縫合；術(shù)后均給予肌注青霉素鈉8×104U/只，以預(yù)防感染，連續(xù)注射3 d。3 w后，執(zhí)行上述處理及檢測。

2結(jié)果

2.1大鼠腎臟體積、腎實質(zhì)厚度和重量的變化NAC組和NS組在用藥后第1天左腎體積均比右腎顯著增大(P<0.05)，左腎實質(zhì)厚度較右腎顯著變薄(P<0.05)，提示復(fù)制模型成功；解除梗阻3 w后3組大鼠左腎體積和右腎比較已無顯著差異(P>0.05)，與解除梗阻前比較明顯縮小(P<0.05)，說明梗阻解除成功。見表1。

表1　大鼠腎臟體積和腎實質(zhì)厚度變化 ± s)

與同組右腎比較：1)P<0.05

2.2造影劑對大鼠體內(nèi)NGAL的影響NAC組和NS組用藥后第1天及解除梗阻后3 w血清NGAL均較模型對照組顯著升高(P<0.05)，NAC組較NS組NGAL水平顯著降低(P<0.05)，同組前后比較無顯著性變化(P>0.05)。見表2。

表2　造影劑對大鼠體內(nèi)NGAL的影響

與模型對照組比較：1)P<0.05；與NS組比較：2)P<0.05

2.3造影劑對腎小管細(xì)胞凋亡的影響用藥后第1天，3組左腎小管細(xì)胞凋亡率比較無顯著性差異(P>0.05)；解除梗阻后3 w，NAC組左腎小管細(xì)胞凋亡率低于模型對照組及NS組(P<0.05)。見表3。

2.4造影劑對腎Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響用藥后第1天，3組左腎Bcl-2 mRNA表達(dá)比較無顯著差異(P>0.05)；解除梗阻后3 w，NAC組左腎Bcl-2 mRNA表達(dá)高于模型對照組及NS組(P<0.05)，見表4，圖1。

表3　造影劑對腎小管細(xì)胞凋亡率的影響 ± s)

與模型對照組比較：1)P<0.05，下表同

圖1　造影劑對腎Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

組別n用藥后第1天解除梗阻后3wNAC組121.262±0.1421.243±0.1451)NS組121.417±0.1511.087±0.1421)模型對照組101.372±0.1680.858±0.153

3討論

分泌性尿路造影(IVU)是臨床上泌尿外科梗阻性疾病最常用的檢查項目之一，目前使用較廣泛的造影劑是碘造影劑，使用造影劑時可能會產(chǎn)生一些不良反應(yīng)〔9〕，據(jù)統(tǒng)計，造影劑是造成住院病人急性腎損傷(AKI)的主要原因，發(fā)生率報告不一〔10，11〕，在院內(nèi)獲得性AKI中位列第三〔12〕。碘造影劑引起的AKI的機(jī)制尚未完全闡明，而造影劑腎臟損傷的發(fā)生和嚴(yán)重程度與造影前腎功能損害程度相關(guān)〔3，4〕。而對于單側(cè)尿路梗阻的個體，綜合腎功能大多正常，但是梗阻側(cè)的腎功能會存在不同程度的損害，腎小球濾過率下降〔13〕，此時輸注造影劑，會在腎內(nèi)蓄積而引起損害。

NGAL蛋白是一新型蛋白，在AKI早期尿液和血清中即可檢測到，對因?qū)Ρ葎┮鸬哪I損傷具有腎臟保護(hù)作用，可作為急性腎損傷早期診斷的生物標(biāo)記〔14，15〕。近年研究發(fā)現(xiàn)腎缺血性損傷后，NGAL蛋白在腎單位多處表達(dá)上調(diào)，以近端腎小管和細(xì)胞再生處最為明顯，其機(jī)制可能是NGAL蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)鐵到近端腎小管細(xì)胞，在鐵作用下血紅素加氧酶-1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用。NGAL基因是缺血性腎損傷早期主要的誘導(dǎo)基因之一，在早期缺血性損傷的大鼠腎中證實NGAL mRNA表達(dá)增加和NGAL蛋白分泌增多，且NGAL蛋白的量與缺血程度、缺血持續(xù)時間呈正比。Bcl-2基因是一類抗細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，其表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。通過上調(diào)抗凋亡的Bcl-2的基因表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以影響凋亡的發(fā)生。

目前認(rèn)為可能有效的藥物主要為NAC和抗壞血酸，NAC是一種抗氧化劑，已有不少研究采用NAC干預(yù)造影劑腎損傷過程〔16，17〕。本研究提示在同樣單側(cè)輸尿管梗阻動物模型中，造影劑產(chǎn)生了明顯的腎損傷，而且這種損傷在解除梗阻后并沒有恢復(fù)趨勢，推測單側(cè)輸尿管梗阻所致的腎功能下降加劇了造影劑的腎毒性，而NAC對單側(cè)腎積水大鼠造影劑引起的腎損害的具有一定的保護(hù)作用，可能是通過上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)抑制腎小管細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。

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〔2014-09-16修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)