廣西壯族長(zhǎng)壽群體白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與TERC基因變異的相關(guān)性

廣西壯族長(zhǎng)壽群體白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與TERC基因變異的相關(guān)性

黎海燕1羅曉秋劉承武王藝苑吳華裕2葛琳彭均華潘尚領(lǐng)

(廣西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣西南寧530021)

摘要〔〕目的探討廣西壯族長(zhǎng)壽群體白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與端粒酶基因hTERC多態(tài)性的相關(guān)性。方法采用TaqMan MGB探針檢測(cè)廣西壯族長(zhǎng)壽群體TERC基因位點(diǎn)(rs12696304、rs16847897和rs3772190)多態(tài)性，并與其第一代子女組及同地區(qū)普通人群即對(duì)照相比較，同時(shí)分析其與白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度(LTL)的相關(guān)性。結(jié)果(1)rs12696304、rs16847897及rs3772190的基因型頻率在三個(gè)組間的分布無(wú)差異，P值分別為0.83、0.33和1.00；等位基因頻率在三個(gè)組間也是相似的，P值分別為0.70、0.83和0.98；三個(gè)位點(diǎn)的最小等位基因分別是C、G和G。(2)TERC基因三個(gè)位點(diǎn)的不同基因型之間的LTL在總?cè)巳?、長(zhǎng)壽組及子女組均無(wú)明顯差異，對(duì)照組在位點(diǎn)rs3772190，GA基因型LTL最長(zhǎng)，其次為GG基因型，AA基因型LTL最短，P=0.02。(3)建立LTL的多元線性回歸方程，總?cè)巳褐酗@示LTL與年齡是明顯相關(guān)的，但與TERC基因位點(diǎn)的各基因型并不相關(guān)。結(jié)論TERC基因多態(tài)性對(duì)廣西壯族長(zhǎng)壽群體LTL無(wú)明顯影響。

關(guān)鍵詞〔〕端粒酶基因；端粒長(zhǎng)度；長(zhǎng)壽

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R339.36〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360066)，廣西自然科學(xué)

通訊作者：潘尚領(lǐng)(1965-)，男，博士，教授，主要從事衰老與長(zhǎng)壽遺傳學(xué)研究。

1南寧輸血醫(yī)學(xué)研究所

2廣西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室

第一作者：黎海燕(1978-)，女，在讀博士，助理研究員，主要從事衰老與長(zhǎng)壽遺傳學(xué)及輸血研究。

Study on the association between leukocyte telomere length and genetic variants on TERC gene of Guangxi Zhuang longevity population

LI Hai-Yan, LUO Xiao-Qiu, LIU Cheng-Wu,etal.

Department of Pathophysiology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the potential relationship between polymorphism of TERC and leukocyte telomere length(LTL) in Guangxi Zhuang longevity population.MethodsGenotyping of TERC SNPs (rs12696304, rs16847897and rs3772190) were performed with TaqMan MGB for the members from longevity population (longevity group, n=485), and their polymorphism were compared with their offspring population (offspring group, n=627), and controls without a familial history of exceptional longevity in the same area(control group, n=218); at the same time the possible association between TERC genotypes and LTL in three groups were evaluated.Results(1) Genotypic frequencies of SNP rs12696304 , rs16847897 and rs3772190 between the three groups were similar (P=0.83, 0.33 and 1.00, respectively); the allelic frequencies among the three groups also showed no significant difference (P=0.70, 0.83 and 0.98, respectively); the minor alleles were C, G and G. (2) Between different genotypes of three loci of TERC, LTL showed no difference among the three groups; but in control group, the LTL of G carriers of rs3772190 (GG/GA) was significantly longer than AA genotype carriers. (3) Multiple linear regression analysis showed that LTL significantly correlated with age, but not with the genotypes of three TERC loci.ConclusionsThere is no obvious correlation between TERC polymorphism and LTL in Guangxi Zhuang longevity population.

【Key words】TERC; Telomere length; Longevity

端粒酶是一種特殊的核蛋白反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體，負(fù)責(zé)端粒DNA重復(fù)序列的再合成，確保端粒的正常修復(fù)和端粒長(zhǎng)度(TL)的維持，由端粒酶RNA元件(hTERC)、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)及端粒酶相關(guān)蛋白等組成〔1〕。端粒酶活性主要取決于這兩個(gè)亞單位，其中hTERC為非編碼的RNA，在端粒合成時(shí)提供模板序列，hTERT為125 kD的單鏈多肽，在端粒合成時(shí)起催化作用〔2〕。端粒與衰老關(guān)系密切，TL隨年齡增加而逐漸縮短在許多研究中已經(jīng)得到證實(shí)〔3,4〕，近年已逐步成為人類(lèi)衰老重要的生物學(xué)標(biāo)記之一。端粒酶是TL的主要調(diào)控因素之一，那么端粒酶基因的突變是否會(huì)影響TL？本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞TL(LTL)在壯族長(zhǎng)壽群體中有一定的遺傳傾向〔5〕。本研究擬通過(guò)對(duì)廣西壯族長(zhǎng)壽群體的端粒酶TERC基因常見(jiàn)變異的三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(rs12696304、rs16847897和rs3772190)進(jìn)行基因型檢測(cè)，了解三個(gè)組間這些位點(diǎn)的基因型及等位基因的頻率分布情況，并分析其與LTL的相關(guān)性，以探討TERC基因多態(tài)性對(duì)LTL的影響。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象及標(biāo)本的采集長(zhǎng)壽組主要為廣西地區(qū)(包括東蘭、鳳山、都安、巴馬及平果縣)的壯族≥90歲的長(zhǎng)壽老人，共485人，其中男117人，女368人，平均年齡(93.17±3.02)歲；子女組為長(zhǎng)壽老人的第一個(gè)子或女，共627人，其中男477人，女150人，平均年齡(57.75±7.80)歲；對(duì)照組為同地區(qū)的普通人群，其家族史中沒(méi)出現(xiàn)過(guò)≥90歲的老人，且與長(zhǎng)壽老人無(wú)任何的血緣關(guān)系，共218人，其中男121人，女97人，平均年齡(64.63±10.15)歲。根據(jù)“知情同意”原則采集研究人群的血樣，用經(jīng)典苯酚/氯仿法提取基因組DNA。所有對(duì)象在采樣前均接受問(wèn)診及體格檢查及認(rèn)知、自理能力的測(cè)試，基本排除糖尿病、心腦血管病變及老年癡呆等相關(guān)疾病。

1.2研究方法

1.2.1LTL的測(cè)定采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)外周血白細(xì)胞相對(duì)TL進(jìn)行測(cè)定，端粒的引物：上游：5′ ACACTAAGGTTTG GGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT3′，下游：5′TGTTAGGTAT CCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA 3′；內(nèi)參36B4基因的引物：上游：5′CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC 3′，下游：5′ CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA 3′，具體方法參照文獻(xiàn)〔5〕。

1.2.2TERC基因三個(gè)位點(diǎn)基因型的檢測(cè)針對(duì)TERC基因三個(gè)位點(diǎn)rs12696304、rs16847897及rs3772190的核酸序列設(shè)計(jì)TaqMan探針，采用FAM及VIC熒光標(biāo)記的兩種報(bào)告基團(tuán)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系包含：TaqMan Universal PCR Master Mix 5 μl、引物/探針0.7 μl、DNA 1 μl、ddH2O 3.3 μl，總反應(yīng)體積10 μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 10 min；變性92℃ 15 s，退火60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。用ABI 7500 Real Time PCR System分析檢測(cè)結(jié)果。隨機(jī)抽取所有樣品的5%進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)作為質(zhì)控，空白對(duì)照以雙蒸水代替樣本DNA，余成份相同。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用PASW Statistics 18.0軟件，采用擬合優(yōu)度分析研究對(duì)象的Hardy-Weinberg平衡，χ2檢驗(yàn)比較基因型及等位基因的頻率。經(jīng)檢驗(yàn)LTL基本呈正態(tài)分布，采用協(xié)方差分析消除年齡的影響比較各組不同性別或基因型之間的LTL，多元線性回歸建立影響LTL各因素的回歸方程。

2結(jié)果

2.1H-W平衡檢驗(yàn)經(jīng)擬合優(yōu)度分析，TERC基因位點(diǎn)rs12696304、rs16847897和rs3772190均符合H-W平衡(P>0.05)，因此樣本具有一定的群體代表性。

2.2不同分層下各組的LTL情況總體上三個(gè)組間LTL的比較并無(wú)顯著性差異，性別分層后，同性別三個(gè)組間LTL的比較亦無(wú)顯著性差異，同一組內(nèi)不同性別間LTL的比較，顯示對(duì)照組中女性LTL長(zhǎng)于男性，P=0.01，而該趨勢(shì)在長(zhǎng)壽組及子女組中并不存在，P分別為0.71和0.07。見(jiàn)表1。

2.3組間基因型及等位基因頻率的比較位點(diǎn)rs12696304、rs16847897及rs3772190的基因型頻率在三個(gè)組之間分布相似，P值分別為0.83、0.33和1.00；等位基因頻率在三個(gè)組間也無(wú)顯著性差異，P值分別為0.70、0.83和0.98；三個(gè)位點(diǎn)最小等位基因分別為C、G和G。見(jiàn)表2。

表1　不同分層下各組的

表2　三個(gè)組間基因型及等位基因頻率的比較〔 n(%)〕

表3　rs12696304位點(diǎn)TERC基因型對(duì)LTL的影響 ± s)

表4　rs16847897位點(diǎn)TERC基因型對(duì)LTL的影響 ± s)

表5　rs3772190位點(diǎn)TERC基因型對(duì)LTL的影響 ± s)

2.4TERC基因型對(duì)LTL的影響見(jiàn)表3~表5。以年齡為協(xié)變量，用協(xié)方差分析比較各組不同基因型之間的LTL?？?cè)巳骸㈤L(zhǎng)壽組及子女組顯示TERC基因的每個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的基因型之間的LTL無(wú)區(qū)別。對(duì)照組在位點(diǎn)rs3772190 GA基因型LTL最長(zhǎng)，其次為GG基因型，AA基因型LTL最短，P值為0.02。

2.5基因型與LTL的線性關(guān)系對(duì)年齡及各基因型建立LTL的多元線性回歸方程，年齡與LTL有明顯的回歸關(guān)系，未標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)(β)為-0.003，P值為0.000，但TERC位點(diǎn)各基因型與LTL未存在線性關(guān)系。見(jiàn)表6。

表6　總?cè)巳篖TL與各影響因素的線性相關(guān)性

3討論

TL與衰老關(guān)系密切，一般的規(guī)律是年齡越大TL越短，它們之間是負(fù)相關(guān)的關(guān)系，本研究結(jié)果顯示，廣西壯族群體LTL與年齡也呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，支持了這個(gè)觀點(diǎn)。編碼hTERC的基因位于3q26.3〔6〕，TERC基因常見(jiàn)多態(tài)性位點(diǎn)為rs3772190、rs12696304、rs10936599及rs16847897等〔4,7〕。文獻(xiàn)報(bào)道，TERC基因突變可以導(dǎo)致TL的縮短，Shen等〔8〕研究結(jié)果表明：在中國(guó)漢族人群中TERC基因的多態(tài)性位點(diǎn)rs12696304和rs16847897與LTL呈明顯相關(guān)性，rs12696304(G)和rs16847897(C)的個(gè)體具有相對(duì)較短的LTL。很多疾病如骨髓造血障礙、先天角化不良等被發(fā)現(xiàn)與TERC基因突變及TL的縮短相關(guān)聯(lián)〔9〕，Sheng等〔10〕用GWAS確定TL與TERC位點(diǎn)(rs12696304和rs16847897)有關(guān)聯(lián)，與第一四分位數(shù)(最短)的TL相比，第二和第三個(gè)四分位數(shù)的TL可能發(fā)生急性淋巴細(xì)胞性白血病的風(fēng)險(xiǎn)較低，此外，與CC基因型比較，rs16847897 CG基因型患急性淋巴細(xì)胞性白血病的風(fēng)險(xiǎn)率增加29%。長(zhǎng)壽與TL和TERC基因突變也有一定的相關(guān)性，Soerensen等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)丹麥人中rs3772190(A)及rs12696304(G)的男性其LTL較短，而與長(zhǎng)壽有關(guān)的位點(diǎn)是rs3772190。但是，也有TL與TERC基因多態(tài)性并不相關(guān)的報(bào)道：Maubaret等〔11〕發(fā)現(xiàn)TERC基因rs12696304 G、rs10936601 T和rs16847897 C組成的單倍型GTC與低風(fēng)險(xiǎn)的冠心病和Ⅱ型糖尿病患病率是相關(guān)的，但該單倍型對(duì)LTL并無(wú)影響。

廣西壯族自治區(qū)長(zhǎng)壽老人較多，特別是巴馬縣及其所在的紅水河流域包括東蘭、鳳山、都安等縣的長(zhǎng)壽老人眾多，是著名的長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)〔12〕。本文中對(duì)這些地區(qū)及周邊的平果縣長(zhǎng)壽群體進(jìn)行LTL的測(cè)定，推測(cè)，長(zhǎng)壽群體及其子女理論上應(yīng)該是LTL較長(zhǎng)，而對(duì)照組LTL較短，而結(jié)果顯示，LTL在三個(gè)組間并無(wú)差異，區(qū)分性別后LTL在三個(gè)組間的比較亦無(wú)差異，僅在組內(nèi)比較時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組女性LTL長(zhǎng)于男性，表明長(zhǎng)壽組雖然年紀(jì)較大，但其LTL仍與其子女或周?chē)钠胀ɡ夏耆讼喈?dāng)，因此探討TERC基因的多態(tài)性是否可以解釋長(zhǎng)壽老人較長(zhǎng)LTL的機(jī)制。

在不同民族和地區(qū)間，TERC等位基因頻率差異很大，Prescott等〔13〕報(bào)道英國(guó)和加拿大的群體，rs12696304最小等位基因?yàn)镚，頻率分別為0.26和0.27，rs16847897最小等位基因?yàn)镃，頻率分別為0.26和0.28，rs3772190最小等位基因?yàn)锳，頻率為0.25，并發(fā)現(xiàn)rs16847897最小等位基因C與LTL的對(duì)數(shù)成負(fù)相關(guān)的關(guān)系。中國(guó)漢族報(bào)道rs12696304和rs16847897 MAF分別是C(0.32)、G(0.39)〔9〕，和本研究的廣西壯族群體頻率相近。在位點(diǎn)rs3772190中，G等位基因攜帶者LTL較長(zhǎng)，AA基因型LTL最短，因此，該位點(diǎn)在對(duì)照組G>A的變異可能為不利變異。LTL與年齡相關(guān)聯(lián)，這個(gè)結(jié)果和Benetos等〔14〕的報(bào)道是一致。

綜上所述，本研究考慮除TL的變化對(duì)衰老的影響外，長(zhǎng)壽的獲得可能還有其他因素的影響?？傊L(zhǎng)壽是一個(gè)復(fù)雜的表型，TL的使用給我們提供了一個(gè)研究老年疾病的新維度〔14〕，其更深的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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〔2014-07-04修回〕

(編輯袁左鳴)