脾氣虛大鼠骨骼肌組織鈣調(diào)蛋白信號通路中CaM及CaMKⅡ基因表達變化

·基礎研究·

脾氣虛大鼠骨骼肌組織鈣調(diào)蛋白信號通路中CaM及CaMKⅡ基因表達變化

成映霞段云燕段永強1，2程衛(wèi)東2楊曉軼1杜娟劉靚朱立鳴梁玉杰1安耀榮1高建德田茸

(甘肅中醫(yī)學院甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅蘭州730020)

摘要〔〕目的探討脾氣虛大鼠骨骼肌組織鈣調(diào)蛋白信號通路中鈣調(diào)蛋白(CaM)、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(CaMK)Ⅱ基因表達變化規(guī)律。方法受試動物隨機分為空白組、脾氣虛模型組(7 d、14 d、21 d組)，每組10只。除空白組外，其余受試動物采用復合法(苦寒破氣法、力竭法及饑飲失常法)成功建立脾氣虛證大鼠模型后，在觀察各組大鼠一般生存狀態(tài)、脾虛證宏觀證候積分、平均每日攝食量、平均每日體重增加量和負重游泳耐力的同時，采用實時熒光定量PCR技術檢測骨骼肌組織CaM信號通路中CaM、CaMKⅡ基因表達水平的變化。結(jié)果與空白組比較，脾氣虛7 d、14 d、21 d組大鼠一般生存狀況較差，脾虛宏觀證候積分顯著升高(P<0.05)，平均每日攝食量、平均每日體重增加量和負重游泳耐力降低(P<0.05)，骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ基因相對表達量顯著降低，且以脾氣虛模型21 d組變化顯著(P<0.05)。結(jié)論脾氣虛大鼠骨骼肌組織CaM信號通路中CaM、CaMKⅡ基因表現(xiàn)為低表達水平。

關鍵詞〔〕脾氣虛證；鈣調(diào)蛋白信號通路；鈣調(diào)蛋白；鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(81160420)；甘肅省自然科學基金(1010RJZA148)；甘肅省教育廳基金(1006-05)

通訊作者：段永強(1974-)，男，副教授，主要從事中醫(yī)臨床基礎、脾胃病和老年病研究。

1甘肅中醫(yī)學院甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)新工程重點實驗室

2蘭州大學基礎醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合研究所

第一作者：成映霞(1976-)，女，副教授，碩士，主要從事中醫(yī)脾胃病和中醫(yī)基礎理論的教學、臨床和科研工作。

The expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA in calmodulin signaling pathways in skeletal muscle of rats with spleen-qi deficiency

CHENG Ying-Xia，DUAN Yun-Yan，DUAN Yong-Qiang，etal.

Gansu College of TCM，Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province，Lanzhou 730020，Gansu，China

Abstract【】ObjectiveTo research the expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA in calmodulin signaling pathways in skeletal muscle of rats with spleen-qi deficiency.MethodsRats were randomly divided into normal，spleen-qi deficient model groups (observed on 7 d，14 d and 21 d)，10 rats in each.The spleen-qi deficient model rats were made by rhubarb，exhaustive and hungry method; then the general condition，macroscopic spleen deficiency syndrome integral，the average food intake，daily weight gain and loading swimming endurance were evaluated，and the expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA in skeletal muscle tissue were evaluated by real time fluorescent quantitative PCR.ResultsCompared with those of normal group，the general of survival was poor，macroscopic spleen deficiency syndrome integral was increased(P<0.05)，the average food intake，average daily weight gain and loading swimming endurance were decreased(P<0.05)，and relative expression of CaM，CaMKⅡ mRNA in skeletal muscle tissue were decreased in model group，this difference was obvious on spleen-qi deficient model 21 d group(P<0.05).ConclusionsThe expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA are decreased in calmodulin signaling pathways in skeletal muscle of rats with spleen-qi deficiency.

【Key words】Spleen-qi deficiency; Calmodulin signaling pathways; Calmodulin; Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ

脾氣虛證作為中醫(yī)臨床常見的臟腑疾病證候之一，主要以消化道功能障礙或減弱為主的全身性生理功能減弱；同時，中醫(yī)認為“脾主運化”，“脾氣散精”而將水谷精微輸布全身，內(nèi)至五臟六腑、外達四肢百骸，充養(yǎng)肌體，故有“脾主身之肌肉”之論。本研究基于“脾虛”可導致機體神疲乏力、形體消瘦甚至肌肉萎廢不用等癥狀的病理機制，并結(jié)合具有多種生物學功能的鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(CaMK)Ⅱ信號通路，以脾氣虛證大鼠為對象，研究骨骼肌組織鈣調(diào)蛋白(CaM)、CaMKⅡ基因在脾氣虛證病程中的動態(tài)表達規(guī)律，以期從CaMKⅡ信號通路角度揭示脾氣虛證發(fā)生的內(nèi)在機制。

1材料與方法

1.1動物3月齡SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～190 g，甘肅中醫(yī)學院醫(yī)學實驗中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2011-0001-0001011；實驗設施合格證號：SYXK(甘)2011-0001-0000314。本實驗中動物處理的相關程序遵守了中國國家健康與醫(yī)學研究委員會(NHNRC)動物道德準則并得到了甘肅中醫(yī)學院動物實驗倫理委員會的批準。

1.2藥物與試劑中藥均購自蘭州復興厚中藥材有限責任公司。大黃、厚樸、枳實按2∶1∶1組成，以上方藥分別常規(guī)煎煮、去渣濾出藥液加熱濃縮至每1 ml藥液含生藥2 g，冷卻后置4℃冰箱備用，使用時稀釋至所需濃度。

β-actin、CaM、CaMKⅡ引物：寶生物工程(大連)有限公司；TRIzol 試劑(批號AK7208-1)、反轉(zhuǎn)錄及Real Time qPCR試劑盒(批號0000036802)均購自Promega Corporation。

1.3主要儀器DF110型電子分析天平(江蘇常熟衡器工業(yè)公司)，XYJ80-2離心機(廣東塘廈駿越機電設備廠)，BIOMATE 3S核酸蛋白測定儀，S1000TM逆轉(zhuǎn)錄儀，Chemi DOC XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)，CFX96TM Optics Module PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.4分組與造模48只SPF級Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)1 w后，按體重從小到大編號，采用隨機數(shù)字表法分為空白組、脾虛模型組(7 d、14 d、21 d)，每組12只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。

參考文獻脾氣虛證模型〔1〕：以苦寒破氣法(大黃、枳實、厚樸)、游泳力竭法及饑飽失常法三因素復合法復制脾氣虛證模型：(1)苦寒破氣法：造模組大鼠每日上午按7.5 g·kg-1·d-1大黃枳實厚樸制劑液灌胃，每日1次；(2)游泳力竭法：每日下午2：00使大鼠負重游泳，于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體重10%的保險絲，放入水深50 cm、水溫20℃的水槽中游泳，并記錄大鼠游泳耐力時間，以游泳力竭(即大鼠鼻尖沒入水面10 s)為度，每日1次。(3)饑飽失常法：每日8：00給予定量飼料，20：00撤去飼料并稱量剩余量，隔日再給予定量飼料，自由飲水。造模期間，空白組大鼠每日上午按1 ml/100 g體重灌服生理鹽水，并給予抓捏刺激，每日上午、下午各1次，每次定時給予定量飼料稱量剩余量，自由飲水。

1.5脾氣虛大鼠一般生存狀況、脾虛宏觀證候評分、平均每日攝食量和平均每日體重增加量測定

1.5.1脾虛證模型宏觀證候表現(xiàn)及評分標準模型復制成功評估標準依據(jù)衛(wèi)生部藥政局頒布的《中藥治療脾虛證的臨床研究指導原則》〔2〕和《中醫(yī)實驗動物模型方法學》〔3〕并結(jié)合大鼠的生物學特征擬定。評分標準：①蜷縮扎堆計1分；②瞇眼弓背、背毛無光澤計1分；③攝食量減少計1分；④體重增加緩慢或下降，同比消瘦計2分；⑤便形質(zhì)軟或溏稀計2分；⑥肛溫下降計1分；⑦游泳耐力下降計2分。

1.5.2大鼠平均每日體重增加量和攝食量的測定〔4，5〕各組大鼠于造模及治療前用精確電子秤測定初始體重，并于每日8：00給食前測定體重和所給飼料量，至次日8：00測定飼料剩余量并記錄各組大鼠取材前3 d平均每日攝食量。

1.6標本采集與檢測造模時分別于第7、14、21日取材并制備待檢樣本。各組大鼠于末次灌胃給藥后，禁食不禁水24 h，烏拉坦(1 g/kg)麻醉采血后斷頭處死并制備待檢標本。骨骼肌組織的收集：受試動物麻醉處死后，迅速將骨骼肌組織(股四頭肌)截取，其中一部分骨骼肌組織置于用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的凍存管中，-80℃冷凍保存檢測CaM、CaMKⅡ基因表達。

1.7骨骼肌CaM、CaMKⅡ基因表達水平檢測采用實時熒光定量PCR法。取適量骨骼肌組織，用Trizol法抽提總RNA：將保存于-80℃冷凍冰箱中的各組大鼠骨骼肌組織稱取50 mg置于研缽中，加入 1 ml Trizol 研磨均勻，冰上孵育5 min 后，4℃、12 000 r/min離心5 min；移入離心管中，冰上孵育5 min 后加0.2 ml氯仿，震蕩后4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液移至新離心管，加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育10 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入1 ml 75%乙醇，震蕩后4℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液后室溫下干燥，加入 50 μl DEPC 處理水溶解RNA。核酸定量分析儀測定其OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0，經(jīng)總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的RNA符合純度要求，可用于后續(xù)PCR。反轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA：在0.5 ml去酶管中加入總RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μl、Random Primer 1 μl，加Nuclease-Free Water至10 μl；70℃變性5 min，然后冰上放置5 min以上；加入逆轉(zhuǎn)錄Go ScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μl，MgCl2(25 mmol/L)2 μl，PCR Nucleotide Mix(10 mmol/L)1 μl，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μl，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μl，Nuclease-Free Water至10 μl，總體積為20 μl。混勻配制的反應混合物，短暫離心后25℃溫浴5 min，42℃反應60 min，再70℃ 15 min滅活處理，所得單鏈cDNA放置于-20℃?zhèn)溆?。引物設計：從NCBI中查尋目標基因ID及序列，由TAKARA公司〔寶生物工程(大連)有限公司〕設計、合成目標基因引物。引物序列：β-actin正義5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，反義5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，產(chǎn)物長度150 bp；CaM正義5′-TCAGAACCCAACAGAGGCTGAA-3′，反義5′-GTCAAAGACTCGGAATGCCTCAC-3′，產(chǎn)物長度160 bp；CaMKⅡ正義5′-GATGTGCGACCCTGGAATGA-3′，反義5′-ATGTAGGCGATGCAGGCTGAC-3′，產(chǎn)物長度183 bp。實時熒光定量PCR以β-actin作為內(nèi)參基因，相同模板相同基因設3復孔、6次平行實驗，得到各擴增反應的Ct值。反應體系根據(jù)GoTaq 2-Step RT-qPCR試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕說明書配制。反應參數(shù)：預變性95℃、2 min，變性95℃、15 s，退火60℃、60 s，循環(huán)40次，終末延伸65℃、5 s。連續(xù)檢測熒光并記錄擴增曲線，采用樣點擬合法分析結(jié)果得到目的基因和β-actin的Ct值。分析溶解曲線，用比較Ct值法計算相對表達量：ΔΔCt=(測試組目的基因Ct值-測試組內(nèi)參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值)，相對表達量=2-ΔΔCt。

2結(jié)果

2.1各組大鼠一般生存情況空白組大鼠始終表現(xiàn)為反應靈敏、活動及飲食量正常、被毛濃密柔順而有光澤、糞便呈棕褐色顆粒狀。脾虛模型各組大鼠多數(shù)在第5天即開始出現(xiàn)倦臥、被毛稀疏干枯；第7天后出現(xiàn)怠動少食、肛周污穢，甚至動作遲緩；第14天后出現(xiàn)怠動少食、消瘦弓背、肛周污穢，部分動物出現(xiàn)脫肛、動作遲緩，并逐漸出現(xiàn)體重減輕、大便稀軟呈橘黃色，而且隨著造模時間的延長上述癥狀表現(xiàn)突出；尤其在脾虛21 d組中，隨著造模時間的延長，大鼠生存能力明顯下降，表現(xiàn)為怠動少食、消瘦弓背、毛發(fā)枯槁疏散、肛周污穢，部分大鼠瞇眼蜷縮、反應遲鈍，體重增長明顯減緩。

2.2各組大鼠平均每日體重增加量和游泳耐力時間比較與空白組比較，脾氣虛7 d、14 d組大鼠體重增加量、游泳耐力時間有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，脾氣虛21 d組大鼠體重增加量、游泳耐力時間均顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與脾氣虛7 d組比較，21 d組大鼠游泳耐力時間顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠平均每日體重增加量和

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與脾氣虛7 d組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.3各組大鼠平均每日攝食量和脾虛宏觀證候積分比較與空白組比較，脾氣虛7 d組大鼠平均每日攝食量有降低趨勢，但組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，脾氣虛14 d、21 d組大鼠平均每日攝食量顯著降低(P<0.05)，而且脾氣虛7 d、14 d、21 d組大鼠脾虛宏觀證候積分顯著升高(P<0.01)；與脾氣虛7 d組比較，脾虛21 d組大鼠脾虛宏觀證候積分顯著升高(P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠平均每日攝食量和脾虛宏觀

2.4各組大鼠骨骼肌組織CaM/CaMKⅡ基因表達比較通過熔解曲線得知，本研究的擴增具有特異性。與空白組比較，脾氣虛7 d組大鼠骨骼肌組織CaM基因相對表達量有降低趨勢，但組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，脾氣虛14 d、21 d組大鼠骨骼肌組織CaM基因相對表達量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且與脾氣虛7 d組比較，21 d組大鼠骨骼肌組織CaM基因相對表達量降低更顯著(P<0.05)；而脾氣虛7 d、14 d組大鼠骨骼肌組織CaMKⅡ基因相對表達量有降低趨勢，但組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，脾氣虛21 d組大鼠骨骼肌組織CaMKⅡ基因相對表達量顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3　脾虛各組大鼠骨骼肌組織CaM/CaMKⅡ基因表達的

3討論

脾虛證的病理機制主要以消化系統(tǒng)功能紊亂為主，臨床表現(xiàn)見面色淡白或萎黃、納呆少食、惡風易感、腹脹腹瀉等，嚴重脾虛者則見神疲乏力、少氣懶言、肢體倦怠、形體消瘦等癥狀。本研究建立的模型大鼠出現(xiàn)的癥候群與《實驗動物和動物實驗技術》〔6〕和《醫(yī)學實驗動物學》〔7〕描述的大鼠生理特點、《實用中醫(yī)證候動物模型學》〔8〕以及總結(jié)近10年醫(yī)學期刊文獻資料建立的脾虛大鼠癥狀評價標準〔9〕的依據(jù)相吻合。結(jié)合國內(nèi)對脾虛動物模型研究的文獻，筆者認為復建脾虛大鼠模型的造模持續(xù)時間以21 d為宜，這與多數(shù)學者復建脾虛證模型的持續(xù)時間相一致。

因為大鼠平均每日攝食量可以反映其攝食行為和基礎代謝，而平均每日體重增加量可以反映機體物質(zhì)代謝與合成以及生長發(fā)育狀況〔10〕；同時機體疲勞狀態(tài)或不耐疲勞的客觀生理表現(xiàn)主要是運動耐力的下降，而負重游泳力竭時間是反映機體運動耐力的重要指標〔11〕。本實驗結(jié)果說明隨著造模時間的延長，脾氣虛大鼠逐漸出現(xiàn)平均每日攝食量下降、平均體重增加緩慢、抗疲勞耐力和基礎代謝功能下降。

細胞信號轉(zhuǎn)導理論認為，在CaM細胞信號通路中，CaM作為細胞內(nèi)鈣離子受體可與游離鈣離子可逆性結(jié)合，并激活下CaM依賴的蛋白激酶——CaMKⅡ發(fā)揮作用。CaM牽連許多細胞內(nèi)生理過程〔12〕，包括調(diào)節(jié)肌肉收縮和舒張(包括平滑肌和骨骼肌、心肌)；調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能，包括神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、突觸傳遞、軸漿運輸；參與刺激分泌耦聯(lián)及調(diào)節(jié)糖代謝等，說明CaM信號轉(zhuǎn)導途徑及其信息分子在機體多系統(tǒng)生理功能的正常發(fā)揮中具有重要生物學作用。而且中醫(yī)認為“脾胃為氣血生化之源”、“脾在體合肌肉而主四肢”，即通過脾胃運化水谷精微化生氣血而濡養(yǎng)四肢百骸和肌肉組織；中醫(yī)實際臨床中的臟腑病癥亦表現(xiàn)出脾虛可導致神疲乏力、形體消瘦甚至肌肉萎廢不用的病癥。故本研究通過觀察脾虛證病程中骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ基因的動態(tài)表達規(guī)律，以期從CaMKⅡ信號通路角度揭示脾氣虛證發(fā)生的深層次病理機制。本研究結(jié)果表明脾氣虛大鼠骨骼肌組織CaM信號通路中CaM、CaMKⅡ基因為低水平表達。

4參考文獻

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〔2015-01-11修回〕

(編輯袁左鳴)