瓜氨酸對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥大鼠模型急性腎損傷的保護(hù)作用研究

瓜氨酸對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥大鼠模型急性腎損傷的保護(hù)作用研究*

廖凱蔡彬羅玉龍黃偉張森△

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院廣西南寧530021)

[摘要]目的探討瓜氨酸對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥大鼠模型急性腎損傷的保護(hù)作用。方法選取96只成年雄性Wistar大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、假手術(shù)組、膿毒癥組、治療組,每組6只。對(duì)照組不經(jīng)任何處理；假手術(shù)組僅開腹翻動(dòng)腸管后關(guān)腹；膿毒癥組與治療組行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecal Ligation and Puncture,CLP))；治療組術(shù)前一周胃飼L-瓜氨酸200 mg/kg·d-1。造模24 h取血、處死大鼠，測(cè)定各組血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)濃度；腎臟組織行蘇木素-伊紅(HE)染色觀測(cè)組織病理學(xué)改變；運(yùn)用懸浮液相芯片技術(shù)檢測(cè)各組腎臟組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組相比，膿毒癥組血清尿毒氮、肌酐及腎組織TNF-α、IL-6水平均顯著升高(P<0.05)，腎組織HE染色顯示大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性。與膿毒癥組相比，治療組血清尿毒氮、肌酐及腎組織TNF-α、IL-6水平均明顯下降，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。腎組織病理改變也明顯減輕。結(jié)論瓜氨酸可抑制腎臟組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，說明瓜氨酸可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)水平，從而在膿毒癥腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]膿毒癥;瓜氨酸;急性腎損傷;TNF-α;IL-6

基金項(xiàng)目：*國家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目號(hào)：81160235)

通訊作者△

[中圖分類號(hào)]R574.6[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[收稿日期：2015-04-10]

Protective effects of citrulline on acute kidney injury induced by sepsis

Liao Kai，Cai Bin，Luo Yulong，et al.(Department of Colorectal and Anal Surgery,Nanning 530021,China)

Abstract[]Objective To investigate the protective effects on acute renal injury in rats with sepsis. Methods 96 cases of healthy and male Wistar rats were randomly divided into 4 groups which were control group(n=6),sham operation group(n=6),sepsis group(n=6) and treatment group(n=6). Normal control group without any Processing.Animal in sham group did laparotomy flip cecum after anesthesia,then closed the Peritoneal.Sepsis model was reproduced in sepsis group and treatment group with cecal ligation and puncture (CLP),and the rats of treatment group were given L- citrulline 200mg kg-1·d-1 for 7 days before operation. The rats were killed at 24h after operation.Then the concentrations of serum BUN and Cr, the histopathological changes of kidney were merasured, simultaneously monitored the expression level of TNF-a and IL-6 in kidney tissue by liquid chip technology.Results The Serum BUN , Cr and TNF-a , IL-6 level in the sepsis group were significantly increased more than those in the sham operation group(P<0.05) .Compared with the sepsis group, The Serum BUN , Cr and TNF-a , IL-6 level in the treatment group were significantly decreased(P<0.05).Conclusion citrulline inhibit the expression of proinflammatory cytokines TNF-α, IL-6 in renal tissue and reduce serum BUN and Cr concentration,improve kidney function and reduce renal histopathological damage in rats with sepsis.Description citrulline may pass regulate cytokines expression level, which is a protection role in the process of the development of sepsis-induced renal injury.

[Key words]Sepsis; Citrulline;acute kidney injury; TNF-α；IL-6

膿毒癥是外科大手術(shù)后常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，亦是外科危重病房最常見的死亡原因[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，急性腎損傷(AKI)是膿毒癥患者死亡的首位獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]，預(yù)防和控制AKI在膿毒癥患者中的發(fā)生發(fā)展可明顯降低膿毒癥患者死亡率。目前認(rèn)為炎癥介質(zhì)、氧自由基、NO的過度生成與膿毒癥AKI發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)[3]，其中抗炎/抑炎因子失衡是AKI發(fā)生發(fā)展的重要因素[4、5]。瓜氨酸是一類非必須氨基酸，可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為精氨酸，同時(shí)亦能負(fù)反饋調(diào)節(jié)NO生成[6]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸可在大鼠缺血-灌注腎損傷以及糖尿病大鼠腎損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[7、8]。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)建立膿毒癥大鼠模型，觀察瓜氨酸對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥大鼠模型急性腎損傷的保護(hù)作用，為臨床降低術(shù)后膿毒癥的死亡率提供新的思路和理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1主要材料和儀器瓜氨酸(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)，生化自動(dòng)分析儀(AU680，貝克曼)，液相芯片生物檢測(cè)試劑盒(RECYTMAG-65K，Millipore)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組SPF級(jí)雄性Wistar大鼠24只，體重250~300 g，7~10周齡(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。按隨機(jī)數(shù)字表分為四組：對(duì)照組、假手術(shù)組、膿毒癥組、瓜氨酸治療組各6只大鼠。

1.3動(dòng)物模型制備wistar大鼠稱重、編號(hào)。①對(duì)照組不做特殊處理。②假手術(shù)組采用10%水合氯醛0.45 Ml/100 g腹腔麻醉，開腹后翻動(dòng)盲腸，縫合腹部切口。③膿毒癥組行CLP術(shù)，麻醉后沿腹中線做一長(zhǎng)約2 cm切口，定位盲腸后于50%長(zhǎng)度處以手術(shù)絲線結(jié)扎，用12G無菌針頭貫穿腸管，擠出少量腸內(nèi)容物后原位回納盲腸并縫合腹部切口。④治療組術(shù)前一周瓜氨酸灌胃給藥，劑量200 mg/kg·d-1。余操作同膿毒癥組。

1.4標(biāo)本采集與處理：各組大鼠于術(shù)后24 h麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 mL，室溫下靜置，待血清析出后3000 r/min離心15 min，取上清-80℃保存?zhèn)錅y(cè)。取血后處死大鼠，摘取左腎放入4℃生理鹽水中漂洗，去除包膜，腎門結(jié)締組織及血管。切取少量腎皮質(zhì)以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HR染色后光鏡下觀察腎組織病理變化。余標(biāo)本-80℃保存?zhèn)錅y(cè)。

1.5腎功能檢測(cè)取各組大鼠血清標(biāo)本1 mL，采用貝克曼全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐及尿素氮水平。

1.6腎組織TNF-α、IL-6、IL-10檢測(cè)：采用LuminexTM2000液相芯片分析平臺(tái)進(jìn)行TNF-α、IL-6、IL-10檢測(cè)，應(yīng)用MasterPlexTMQT多元數(shù)據(jù)分析軟件包繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行曲線擬合得出相應(yīng)細(xì)胞因子定量檢測(cè)濃度。

2結(jié)果

2.1組織病理學(xué)觀察對(duì)照組與假手術(shù)組未見明顯病理改變；膿毒癥組可見腎皮質(zhì)及間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管上皮腫脹、空泡變性，刷狀緣廣泛脫落，腎小管腔內(nèi)可見少量蛋白管型。治療組與膿毒癥組相比，腎皮質(zhì)及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤減輕，仍可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹，但變性顯著減輕，腎損傷程度未見進(jìn)一步擴(kuò)大。(圖1)

2.2腎功能指標(biāo)變化膿毒癥組血清尿素氮與肌酐較正常組與假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)；治療組與膿毒癥組比較，血清尿素氮及肌酐均明顯下降(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)，見表1。

2.3腎組織細(xì)胞因子水平測(cè)定對(duì)照組腎組織TNF-α與IL-6表達(dá)水平較低且較為平穩(wěn)；膿毒癥組TNF-α、IL-6水平明顯升高(P<0.05)；與膿毒癥組相比，治療組TNF-α、IL-6水平明顯下降(P<0.05)，見表1。

圖1　大鼠腎臟HE染色(×400)

注：?jiǎn)我蛩胤讲罘治黾偈中g(shù)組與對(duì)照組比較，P>0.05；*與假手術(shù)組進(jìn)行比較，P<0.05；

#與假手術(shù)組和膿毒癥組進(jìn)行比較，P<0.05

3討論

在術(shù)后膿毒癥患者中，腎臟是最易累及的器官之一，腎功能輕度損傷便可增加術(shù)后膿毒癥患者的病死率[9、10]。目前研究顯示，膿毒癥腎損傷時(shí)，多種細(xì)胞因子相互作用，形成復(fù)雜交錯(cuò)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，最終形成“瀑布效應(yīng)”[11]，導(dǎo)致腎功能急劇下降，組織結(jié)構(gòu)破壞。

細(xì)胞因子包括促炎和抗炎因子兩類，正常狀態(tài)下，促炎與抗炎因子相互之間維持動(dòng)態(tài)平衡，而在膿毒癥中促炎因子過度分泌和釋放所導(dǎo)致的促炎/抗炎因子失衡是引發(fā)和加重膿毒癥急性腎損傷的重要因素[12~14]。

TNF-α是炎癥反應(yīng)中最早分泌和釋放、促炎作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一也是炎癥因子瀑布效應(yīng)的始動(dòng)因素。膿毒癥中，內(nèi)毒素(LPS)與血漿LPS結(jié)合蛋白(LBP)形成復(fù)合物(LPS-LBP)與單核/巨噬細(xì)胞表面CD14受體結(jié)合，通過JAK-STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)TNF-α合成[15]，進(jìn)而發(fā)揮泛生物學(xué)作用，誘發(fā)IL-1β、IL-6、IL-8等次級(jí)炎癥因子的釋放，放大炎癥信號(hào)、形成級(jí)聯(lián)效應(yīng)[16]。本研究中，膿毒癥組腎組織中TNF-α明顯上升，伴有腎組織大量炎癥細(xì)胞浸潤、腎皮質(zhì)細(xì)胞腫脹變性，以及血清尿素氮和肌酐的顯著上升，提示膿毒癥腎組織中大量TNF-α合成與釋放增加，加劇腎小球炎癥，繼而損傷腎臟功能。

IL-6是次級(jí)促炎癥細(xì)胞因子之一，其本身對(duì)細(xì)胞無直接損傷作用，能夠增強(qiáng)次級(jí)炎癥介質(zhì)C5a發(fā)揮其促炎活性的作用。IL-6常作為細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活的一個(gè)標(biāo)志，其水平可間接反應(yīng)組織損傷程度[17]。本研究中，膿毒癥組IL-6顯著高于假手術(shù)組，提示膿毒癥腎組織損傷，與國外Nechemia等人報(bào)道相一致[18]。

瓜氨酸(Citrulline)又名氨甲酰鳥氨酸，是一種不參與蛋白質(zhì)合成的半必須α-氨基酸。正常機(jī)體瓜氨酸主要在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)合成，在腎臟中經(jīng)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為精氨酸，在維持蛋白平衡的過程中發(fā)揮重要作用[19、20]。此外瓜氨酸可以通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)NO的生成，具有較高的臨床價(jià)值。近年來，關(guān)于瓜氨酸的研究多集中于心血管疾病、代謝性疾病與抗炎等方面。在膿毒癥中，患者血清瓜氨酸下降41%，且瓜氨酸水平低下與膿毒癥預(yù)后不良有關(guān)[21]。Marini等亦發(fā)現(xiàn)腎功能損傷，阻礙瓜氨酸的從頭合成途徑，導(dǎo)致體內(nèi)瓜氨酸水平大幅下降[22]。Persson發(fā)現(xiàn)為糖尿病小鼠補(bǔ)充外源性瓜氨酸可保護(hù)其腎功能，顯著減輕腎小球纖維化和減少蛋白尿[23]。

盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥大鼠模型能較好模擬術(shù)后膿毒癥患者的臨床特點(diǎn)。在本研究中我們?yōu)橹委熃M補(bǔ)充外源性瓜氨酸，發(fā)現(xiàn)大鼠腎組織炎性浸潤與腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性程度較膿毒癥組均有所減輕。而血清尿素氮與肌酐與膿毒癥組相比亦有明顯下降。說明瓜氨酸可減輕膿毒癥的腎組織損傷，抑制血清尿素氮及肌酐水平，從而起到保護(hù)腎功能的作用。進(jìn)一步研究表明，瓜氨酸的干預(yù)明顯降低了腎組織TNF-α與IL-6的水平，提示瓜氨酸可能通過調(diào)控前炎因子TNF-α與IL-6表達(dá)在炎癥早期即發(fā)揮作用。

綜上所述，瓜氨酸能夠抑制盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥大鼠模型腎組織中早期促炎介質(zhì)TNF-α與IL-6的升高，調(diào)節(jié)機(jī)體促炎/抗炎因子平衡，保護(hù)腎功能減輕大鼠腎組織損傷，為術(shù)后膿毒癥治療提供了新的研究方向和理論基礎(chǔ)。

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