苯酚降解菌篩選及降解特性研究

通信作者:徐成斌,副教授。E-mail:xuchengbin80@163.com

苯酚降解菌篩選及降解特性研究

李鮮珠,沈玉冰,馬溪平,王聞燁,李萬龍,張宏亮,徐成斌

(遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院,遼寧 沈陽110036)

摘要：針對焦化廢水生物難降解有機物含量高、實際生產(chǎn)過程中的水質(zhì)和水量變化大的特點,開展了高效菌株處理含酚廢水的試驗研究。從某焦化廠水處理車間生物處理裝置曝氣池活性污泥中馴化、分離和篩選得到4株以苯酚為唯一碳源的高效降解菌,并對其進行鑒定及降解特性研究。結(jié)果表明:初步鑒定h32a2、b31B、h31A和b41a為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.);通過溴化容量法測定苯酚含量,確定了菌株的最佳降解條件為:溫度32℃,pH值7.5,培養(yǎng)時間16h,接種密度1%,且單一菌株h32a2的苯酚最大降解率可達90.55%。通過單一和組合高效菌株對苯酚的降解特性可知,4株高效菌混合的降解效果最佳。因此,混合高效苯酚降解菌處理含酚廢水具有一定的可行性。

關(guān)鍵詞：焦化廢水;苯酚;菌株;降解特性

基金項目:國家“十二五”科技重大專項子課題(2012ZX07202003-05);遼寧大學(xué)本科教學(xué)改革研究項目(JG2013ZD0010);遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院重點學(xué)科資助項目

作者簡介:李鮮珠(1991—),女(朝鮮族),碩士研究生,研究方向環(huán)境工程微生物學(xué)。E-mail:senzuu@163.com

中圖分類號：X703文獻標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2014-12-10編輯：徐娟)

DOI：10.3880/j.issn.1004-6933.2015.03.006

Screening of phenol-degradation bacteria and study of

its degradation characteristics

LI Xianzhu, SHEN Yubing, MA Xiping, WANG Wenye,

LI Wanlong, ZHANG Hongliang, XU Chengbin

(SchoolofEnvironmentScience,LiaoningUniversity,Shenyang110036,China)

Abstract：According to the characteristics that there are high content of bio-refractory organic matters in the coking wastewater and the changes of water quality and water quantity during actual production are great, the authors of this paper mainly studied the treatment of wastewater containing phenol by high efficient strains. four highly efficient degradation bacteria strains which take phenol as the sole carbon source were obtained by means of domestication, isolation and screening to the activated sludge in the aeration tank, a biological treatment device, of the water treatment plant in a coking factory. Those four highly efficient degradation bacteria strains were identified and its degradation characteristics were studied. The results show that the strain h32a2, b31B, h31A and b41a are identified as Pseudomonas sp; Phenol content was measured by brominating volumetric method. The best condition of strain degradation was determined as follows: the degradation temperature was 32℃, the pH value is 7.5, the strain incubation time was 16h, the inoculation density was 1%, and the maximum phenol degradation rate of the strain h32a2 reached 90.55%. We can know that the degradation effect of combined four highly efficient degradation bacteria strains is the best from the degradation characteristics of single and combined strain.The treatment of wastewater containing phenol by mixed high efficient phenol-degradation bacteria was feasible.

Key words： coking wastewater; phenol; strain; degradation characteristics

焦化廢水是煤制焦炭、煤氣凈化及焦化產(chǎn)品生產(chǎn)回收過程中產(chǎn)生的廢水,屬難生化降解的高濃度有機工業(yè)廢水,其有機污染物以酚類化合物為主[1]。焦化廢水的處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法。微生物對有毒有害化合物的降解有著重要的作用,特別是微生物生態(tài)降解系統(tǒng)具有溫和、有效和不產(chǎn)生二次污染等特性,越來越引起科學(xué)家的重視[2-3]。關(guān)于微生物降解苯酚的研究已有許多報道,近幾十年的研究[4]表明,許多微生物參與了此類有機毒物的具有重要環(huán)保意義的生物降解反應(yīng)，有機物可以被菌群利用和分解,直至為無害的最終產(chǎn)物,如CO2、H2O和N2等。

焦化廢水中所含的污染物是一個十分復(fù)雜的混合體系,用單一的菌種,往往難以達到預(yù)期的效果和實際應(yīng)用的需要,而且利用純菌種來分解難降解有機物,可能會停在某一個中間階段,如果沒有其他菌種繼續(xù)分解殘余的中間產(chǎn)物,則廢水處理無法進行到底[5-7]。對微生物進行篩選、馴化,得到高效微生物,而通過合理組合多種高降解能力的微生物菌群來分解有機物,其效率比單一的純菌種更好,因為這樣可以發(fā)揮不同種類微生物的協(xié)同代謝優(yōu)勢,實現(xiàn)多種難降解污染物的同時降解[8]。

高效優(yōu)勢菌技術(shù)在現(xiàn)代廢水治理中的應(yīng)用日益引起人們的興趣與關(guān)注,這一技術(shù)與傳統(tǒng)的生物治理技術(shù)相結(jié)合,已成為生物治理廢水發(fā)展的一種趨勢。

1試驗材料與方法

1.1菌種來源

菌種取自本溪鋼鐵集團公司焦化廠水處理車間生物處理裝置曝氣池活性污泥。

1.2培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、瓊脂15~20g、蒸餾水1000mL,pH 7.2～7.4,121℃ 滅菌30min(含酚溶液)。

液體培養(yǎng)基:蛋白胨0.5g、K2HPO40.1g、MgSO40.05g、蒸餾水1000mL,pH 7.2～7.4,121℃ 滅菌30min(含酚溶液)。

1.3菌種的分離與篩選

將被制成不同稀釋倍數(shù)的活性污泥加入含酚固體培養(yǎng)基,于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,觀察菌落的生長情況,挑選出生長速度快、熒光明亮的菌落。將分離出的菌落分別多次劃線平板培養(yǎng),得到單個菌落。為了分離出對酚有高效降解能力的菌株,對上述菌株進行進一步的篩選。利用搖床進行連續(xù)培養(yǎng),對單一菌株進行酚降解能力的測試。本試驗選用溴化容量法,測試條件:溫度32℃、酚質(zhì)量濃度100～400mg/L。

1.4菌種鑒定

根據(jù)細菌的個體特征、群落形態(tài),革蘭氏染色反應(yīng)和生理生化反應(yīng)將菌種鑒定到屬[9-10]。

1.5不同菌株組合對苯酚的降解率

制備液體培養(yǎng)基,分裝于500mL錐形瓶中,每瓶100mL,121℃滅菌30min。將菌種排列組合后進行降解實驗,組合分別為:①h32a2+b31B、②h32a2+h31A、③h32a2+b41a、④b31B+h31A、⑤b31B+b41a、⑥h31A+b41a、⑦h32a2+b31B+h31A、⑧h32a2+b31B+b41a、⑨h32a2+h31A+b41a、⑩b31B+h31A+b41a、h32a2+b31B+h31A+b41a。將不同組合的菌懸液無菌操作分別接種于液體培養(yǎng)基中,置于搖床上恒溫振蕩培養(yǎng)24h,再無菌操作加入苯酚標(biāo)準液,使培養(yǎng)基中的苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L,搖床恒溫振蕩培養(yǎng)24 h,取出后分別測定苯酚的降解率。

1.6苯酚降解試驗

將處于對數(shù)生長期的菌液(單一菌株和混合菌株的菌懸液)接到液體培養(yǎng)基中,以苯酚作為唯一碳源,按表1的梯度分別考察溫度、pH、苯酚質(zhì)量濃度、接種量和菌株的培養(yǎng)時間對苯酚降解率的影響。

表1　苯酚降解各影響因素的試驗梯度

2結(jié)果與討論

2.1苯酚降解菌的篩選

a. 初始苯酚質(zhì)量濃度為200mg/L。搖床振蕩培養(yǎng)24h后,進行苯酚降解試驗,結(jié)果如表2所示。

表2　各菌株對初始質(zhì)量濃度為200mg/L的苯酚降解率

注:“++”代表降解能力最強;“+”代表降解能力較強;“-”代表降解能力弱。

在初始苯酚質(zhì)量濃度為200mg/L時,整理數(shù)據(jù)后得知，苯酚降解率大于70%有5株菌。5株菌分別為h31A、h32a2、b12a1、b31B、b41a,其中h32a2的降解率最高,為98.87%。

b. 初始苯酚質(zhì)量濃度為300mg/L。搖床振蕩培養(yǎng)24h后,進行苯酚降解試驗。

在初始苯酚質(zhì)量濃度為300mg/L時,進行苯酚降解試驗，整理數(shù)據(jù)可知，苯酚降解率大于70%有5株菌。5株菌分別為h31A、h32a2、b31B、b41a、b12a1,其中h32a2的降解率最高,為95.02%(表3)。

表3　5種菌株對初始質(zhì)量濃度為300mg/L的苯酚降解率

注:“++”代表降解能力最強;“+”代表降解能力較強。

c. 初始苯酚質(zhì)量濃度為400mg/L。搖床振蕩培養(yǎng)24h后。在初始苯酚質(zhì)量濃度為400mg/L時,進行苯酚降解試驗,整理數(shù)據(jù)可知，苯酚降解率大于70%的有4株菌。4株菌分別為h31A、h32a2、b31B、b41a,其中h32a2的降解率最高,為90.55%(表4)。

表4　5種菌株對初始質(zhì)量濃度為400mg/L的苯酚降解率

注:“++”代表降解能力最強;“+”代表降解能力較強;“-”代表降解能力弱。

根據(jù)以上試驗,最后篩選出4株高效苯酚降解菌:h32a2、b31B、h31A和b41a,其降解能力分別為(苯酚質(zhì)量濃度為400mg/L時): 90.55%、88.34%、82.16%和9.80%。

2.2降解菌的鑒定

根據(jù)細菌的個體特征、群落形態(tài),通過革蘭氏染色反應(yīng)和生理生化反應(yīng)將菌種鑒定到屬，試驗結(jié)果見表5。

表5　苯酚優(yōu)勢降解菌的基本特征

注:“G-”表示革蘭氏為陰性。

根據(jù)此試驗結(jié)果,結(jié)合文獻[10],可以認為菌株h32a2、b31B、h31A、b41a為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。

2.3不同菌種組合對苯酚降解率的影響

選取苯酚質(zhì)量濃度為400mg/L,將以上試驗篩選出的4株菌種排列組合后進行降解試驗,測定苯酚降解率，圖1(圖1中橫坐標(biāo)序號分別對應(yīng)本文1.5中不同組別)。

表6　h32a2、b31B、h31A、b41a菌株的生理生化試驗結(jié)果

注:“+”代表陽性;“-”代表陰性。

圖1　不同菌種組合苯酚降解率的變化

試驗發(fā)現(xiàn),菌種組合對苯酚的降解效果各不相同,有些菌種組合的苯酚降解率比單株菌的效率高些,有的菌種組合降解效果則恰恰相反,這可能是菌種間協(xié)同或拮抗作用造成的。由圖1可見,b31B和b41a組合的苯酚降解率最低,而4株菌株混合的組合降解效果是最好的,并且菌株h32a2所在的菌株組合苯酚降解率都較高。這可能是由于b31B和b41a共存時拮抗作用表現(xiàn)明顯,而當(dāng)4株菌株共存時協(xié)同作用大于拮抗作用,且在混合菌株降解過程中極有可能是菌株h32a2起著主導(dǎo)作用。試驗結(jié)果表明，采用混合高效苯酚降解菌處理含酚廢水是可行的。

2.4溫度對高效菌降解苯酚的影響

以溫度為橫坐標(biāo),苯酚降解率為縱坐標(biāo),溫度與混合菌株、單一菌株的苯酚降解率之間的關(guān)系如圖2所示。

圖2　溫度對苯酚降解率的影響

從圖2可見,培養(yǎng)溫度不同,混合菌株和單一菌株對苯酚的降解效率明顯不同。溫度在32℃時,混合菌株的苯酚降解率最高,達98%以上,單一菌株較混合菌株低,但菌株h32a2的苯酚降解率最高為94.83%。在最低溫度24℃時,單一菌株和混合菌株的苯酚降解率均有所降低,在最高溫度40℃時苯酚降解率普遍都較低,混合菌株的降解率為42.63%,菌株h32a2降解率也僅為45.68%。從圖2還可以看出,混合菌株和單一菌株苯酚降解率隨溫度的變化曲線基本上遵循正態(tài)分布。苯酚降解率由最低溫度24℃為開始,隨著溫度的變化曲線升高,苯酚降解率開始上升,32℃達到最大。此后隨溫度的升高苯酚降解率不再上升,反而下降,到40℃時苯酚降解率降至最低。

從本試驗可以看出高效菌降解苯酚的最適宜溫度是32℃,在這個溫度時環(huán)境條件能更好地發(fā)揮菌株的降解性,但溫度的高低影響它們降解率大小的幅度不同,這跟菌株對溫度的反應(yīng)程度有關(guān)。促使各種降解過程的生物酶,其反應(yīng)溫度一般不同,它們對溫度變化的敏感性影響到反應(yīng)速率及反應(yīng)程度,宏觀上表現(xiàn)為影響菌株對苯酚的降解率。

2.5pH值對高效菌降解苯酚的影響

以pH為橫坐標(biāo),苯酚降解率為縱坐標(biāo),pH與混合菌株、單一菌株的苯酚降解率之間的關(guān)系如圖3所示。

圖3　pH值對苯酚降解率的影響

由圖3可見,當(dāng)苯酚質(zhì)量濃度一定、其他培養(yǎng)條件完全相同時,不同pH值對混合菌株、單一菌株降解苯酚的能力也明顯不同?；旌暇暝趐H值為7.5時對苯酚降解率最高,達到98%以上,pH值為6.5、8.5時苯酚降解率較高,在pH值為5.5、9.5時苯酚降解率很低;單一菌株在pH值7.5時苯酚降解率均較高,其中菌株h32a2的降解率最高,達到93.62%?？傮w看來:規(guī)律與溫度類似。苯酚降解率隨pH值變化的曲線呈正態(tài)分布。

2.6 苯酚質(zhì)量濃度對高效菌降解苯酚的影響

以苯酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),苯酚降解率為縱坐標(biāo),苯酚質(zhì)量濃度與混合菌株、單一菌株的苯酚降解率之間的關(guān)系如圖4所示。

圖4　苯酚質(zhì)量濃度對苯酚降解率的影響

由圖4可見,隨著苯酚質(zhì)量濃度的增大,混合菌株及單一菌株對苯酚的降解能力降低。試驗用的4株菌是經(jīng)過逐級在不同苯酚質(zhì)量濃度下篩選、馴化出來的,有一定的耐酚性,除菌b41a外,其余菌株在苯酚質(zhì)量濃度逐漸升高時降解率降低的幅度不大。當(dāng)苯酚質(zhì)量濃度小于400mg/L時,4株菌的苯酚降解率均在75%以上;當(dāng)苯酚質(zhì)量濃度為500mg/L時,只有菌h32a2苯酚降解率高于75%?；旌暇昱c單一菌株苯酚降解率的對比表明:在相同的初始質(zhì)量濃度下,菌株聯(lián)合作用的降解酚的能力較單一菌株效果好。

2.7接種量對高效菌降解苯酚的影響

以接種量為橫坐標(biāo),苯酚降解率為縱坐標(biāo),接種量與混合菌株、單一菌株的苯酚降解率之間的關(guān)系如圖5所示。

圖5　接種量對苯酚降解率的影響

由圖5可見,相同接種量下,混合菌株苯酚降解率高于單一菌株。同時以接種量為9%時各菌株的苯酚降解率最高,其中混合菌株與菌株h32a2苯酚降解率分別達到98.80%和94.25%,但與接種量為1%、3%、5%、7%時相比較,各菌株的苯酚降解率并無太大的提高,這可能與細菌對于苯酚的適應(yīng)能力有關(guān)。如果初始接菌量太少,很少的菌量不能分泌足夠的降解酶以快速適應(yīng)較高濃度的苯酚壓力,當(dāng)接種量增加時,由于細菌數(shù)量增加,在相同苯酚質(zhì)量濃度下,細菌分泌的酶量增加,對于較高的苯酚質(zhì)量濃度具有較好的適應(yīng)性,能較好地降解利用苯酚。如果接種量再提高,由于沒有相對更強的壓力,細菌可以很好生長,所以在試驗中,選擇 1%作為接菌量,其他接種量需菌量大,也不經(jīng)濟。

2.8菌株的培養(yǎng)時間對高效菌降解苯酚的影響

以菌株的培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),苯酚降解率為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時間與混合菌株、單一菌株的苯酚降解率之間的關(guān)系如圖6所示。

圖6　菌株培養(yǎng)時間對苯酚降解率的影響

由圖6可見,在其他條件一樣的情況下,同樣的培養(yǎng)時間,混合菌株的苯酚降解率高于單一菌株。隨著菌培養(yǎng)時間的延長,菌的苯酚降解率逐漸升高,32h時,混合菌株和菌株h32a2的苯酚降解率均為最高值,分別為99.14%和98.77%,但與培養(yǎng)時間為16h和24h比較,苯酚降解率的上升幅度并不大,因此,細菌的培養(yǎng)時間最佳值為16h。

3結(jié)論

a. 以本鋼焦化廠曝氣池中的污泥為菌種來源,經(jīng)過分離、篩選和馴化,最終挑選出4株菌落,分別命名為h32a2、b31B、h31A、b41a,該4株菌都能夠在以苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)基上良好生長,苯酚降解率分別為90.55%、88.34%、82.16%和79.80%。

b. 根據(jù)高效菌菌株個體特征、群落形態(tài),革蘭氏染色反應(yīng)和生理生化反應(yīng),檢索文獻[10],將菌株h32a2、b31B、h31A和b41a初步鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。

c. 研究單一和組合條件下高效菌株對苯酚的降解特性,結(jié)果表明,b31B和b41a組合的苯酚降解率最低,而4株菌混合的降解效果是最好的。這可能是由于b31B和b41a共存的時候拮抗作用表現(xiàn)明顯,而當(dāng)4株菌共存時協(xié)同作用優(yōu)于兩株菌的拮抗作用,因此利用混合高效苯酚降解菌處理含酚廢水是可行的。

d. 對單一菌株和混合菌株進行了溫度、pH值、培養(yǎng)時間、接種量的試驗研究,結(jié)果表明,各單因素試驗中混合菌株的苯酚降解率均高于單一菌株,降解的最佳條件為:溫度32℃,pH值7.5,菌株的培養(yǎng)時間16h,接種密度1%。其中,菌株h32a2在各項降解試驗中都表現(xiàn)出較好的降解效果,一般條件下降解率已達到90.55%,而且還具有耐高濃度的特性,以后應(yīng)進一步對其進行降解特性研究。

參考文獻：

[1] 錢城,田沈,楊秀山.焦化廢水的微生物降解研究進展[J].上海環(huán)境科學(xué),2003,22(2): 129-132.(QIAN Cheng,TIAN Shen,YANG Xiushan.Study progress on coke plant wastewater treatment by microbial biodegradation[J].Shanghai Environmental Sciences,2003,22(2): 129-132.(in Chinese))

[2] 周靜,李素芹,裴琦.新物化法深度處理焦化廢水[J].環(huán)境污染與防治,2009,31(9): 64-67.(ZHOU Jing,LI Suqin,PEI Qi.Advanced treatment of coking-plant wastewater by novel physicochemical method[J].Environmental Pollution & Control,2009,31(9): 64-67.(in Chinese))

[3] LOH Kaichee,CHUNG Taishun,ANG Weifern,et al.Immobilized-cell membrane bioreactor for high-strength phenol wastewater [J].Journal of Environmental Engineering,2000,126(1): 75-79.

[4] 林如亮,齊水冰.焦化廢水菌種篩選及降解研究[J].廣東化工,2004,2(1): 51-54.(LIN Ruliang,Qi Shuibing.Screen tamed bacteria and degrade coke-plant wastewater experiments[J].Guangdong Chemical Industry,2004,2(1): 51-54.(in Chinese))

[5] 姜立春,阮期平,袁利娟,等.高效降酚菌株JY03的篩選及其降解特性研究[J].環(huán)境工程學(xué)報,2011,5 (8): 1912-1916.(JIANG Lichun,RUAN Qiping,YUAN Lijuan,et al.Study on screening and characteristics of a phenol-degrading bacterium strain JY03[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2011,5 (8): 1912-1916.(in Chinese))

[6] 丁軍委,陳豐秋,吳素芳,等.超臨界水氧化方法處理含酚廢水[J].環(huán)境污染與防治,2000,22(1): 1-3.(DING Junwei,CHEN Fengqiu,WU Sufang,et al.Treatment of phenol-containing wastewater by supercritical water oxidation process[J].Environmental Pollution & Control,2000,22(1): 1-3.(in Chinese))

[7] 周集體,關(guān)曉燕,曲媛媛,等.苯酚降解菌株GXY-1分離鑒定降解及其粗酶特性研究[J].大連理工大學(xué)學(xué)報,2010(3): 340-345.(ZHOU Jiti,GUAN Xiaoyan,QU Yuanyuan,et al.Research on isolation,identification of a phenol-degrading strain GXY-1 and characteristics of its degradation and crude enzyme[J].Journal of Dalian University of Technology,2010(3): 340-345.(in Chinese))

[8] 劉興平.苯酚降解菌的分離及降解特性研究[J].環(huán)境保護科學(xué),2008,34(2): 38-40.(LIU Xingping.Selection and screening of phenol degrading microorganism under aerobic conditions and its degrading characteristics[J].Environmental Protection Science,2008,34(2): 38-40.(in Chinese))

[9] 馬放,任南琪,楊基先.污染控制微生物學(xué)實驗[M].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社,2002: 48-84.

[10] 布坎南·吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組,譯.北京: 科學(xué)技術(shù)出版社,1984.