雙咪唑硝基衍生物配合物的合成及其生物活性研究

·化學(xué)與化學(xué)工程·

雙咪唑硝基衍生物配合物的合成及其生物活性研究

楊莉?qū)?,黑嘉慧2,李立1,成昭1,余麗麗1

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安710021;2.陜西航天職工大學(xué)，陜西 西安710100)

摘要：以2-甲基-4-硝基咪唑?yàn)樵习凑瘴墨I(xiàn)方法合成了1,2-二[1-(2-甲基-4-硝基咪唑)]乙烷配體,進(jìn)而制備了其銅、銀配合物,通過(guò)紫外吸收光譜、熒光光譜及黏度法研究所合成的有機(jī)配體及其配合物與DNA相互作用模式,并以二倍稀釋法研究抗厭氧菌的活性。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物與DNA相互作用方式可能為部分插入,并伴隨有靜電式結(jié)合。Cu，Ag配合物對(duì)兩種厭氧菌菌株的抗菌性相對(duì)配體明顯增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：雙咪唑硝基衍生物;金屬配合物;與DNA相互作用;抗厭氧菌

收稿日期：2014-07-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302706);陜西省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(14JK1631);西安醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(2012DOC3)

作者簡(jiǎn)介：楊莉?qū)?女,陜西渭南人,副教授,從事生物無(wú)機(jī)化學(xué)及無(wú)機(jī)藥物化學(xué)方面的研究。

中圖分類(lèi)號(hào)：O614

Synthesis and biological activity of complexes with flexible

bisimidazole nitro-derivative ligand

YANG Li-ning1, HEI Jia-hui2, LI Li1, CHENG Zhao1, YU Li-li1

(1. Department of Pharmacy, Medical University of Xi′an, Xi′an 710021, China;

2.Shaanxi Aerospace Staffs & Vocation University, Xi′an 710100, China)

Abstract:A flexible nitroimidazole derivative 1,2-di-[1-(2-methyl-4-nitroimidazolyl)] ethane was prepared according to the literature method, and its transition metal complexes were synthesized. The binding of the compounds with calf thymus DNA has been investigated by UV, fluorescence spectra and viscosity measurements. With the two-fold agar dilution method, the antiamoebic activities of nitroimidazole derivative and its copper, silver complexes have been determined, respectively. All of the results indicate that the ligand and complexes bind to DNA base pairs by partial intercalation and electrostatic attraction mode. Complexes have better effect of antiamoebic activity than ligand to two kinds of anaerobic bacteria strains.

Key words: flexible bisimidazole nitro-derivative; metal complex; DNA-binding; antiamoebic activity

硝基咪唑類(lèi)藥物是常見(jiàn)的抗厭氧菌類(lèi)藥物,尤其甲硝唑藥物在臨床上的應(yīng)用非常廣泛。但是，隨著時(shí)間的推移,細(xì)菌的耐藥性迅速增加,藥物的毒副作用也突顯出來(lái),因而對(duì)硝基咪唑類(lèi)藥物的構(gòu)效關(guān)系的研究日益深入。對(duì)金屬配合物藥物的抗菌性研究,為近年來(lái)生物無(wú)機(jī)化學(xué)的熱門(mén)研究課題之一。目前這一方面的研究主要集中于Schiff堿過(guò)渡金屬配合物[1],對(duì)硝基咪唑類(lèi)藥物配合物的抗厭氧菌活性的研究相對(duì)較少。本研究采用經(jīng)典的二倍稀釋法藥物敏感實(shí)驗(yàn)原理,初步分析了新合成的硝基雙咪唑衍生物及其銅、銀配合物對(duì)兩種厭氧菌變異鏈球菌(Streptococcus mutans)和伴放線放線桿菌(aggregatibacter actinomycetem)的體外抗菌活性,為進(jìn)一步探討硝基咪唑類(lèi)藥物的抗厭氧菌機(jī)理提供了豐富的實(shí)驗(yàn)素材。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

除小牛胸腺DNA(ct-DNA)為生化試劑,2-甲基-4-硝基咪唑?yàn)榛瘜W(xué)純外,其他試劑均為分析純。

德國(guó)Vario EL-IIIG型元素分析儀,EQUINOX55 型紅外光譜儀,STA449C型熱分析儀;日本1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),F-4500熒光分光光度計(jì);上海Ubbeoldhe黏度計(jì),DDS-307型電導(dǎo)儀。

1.2 配體及配合物的合成

配體1,2-二[1-(2-甲基-4-硝基咪唑)]乙烷(以下用L表示)的合成參照文獻(xiàn)[2-3]。

其合成路線為:

配合物[Cu(L)Cl2]·H2O(1)的合成：準(zhǔn)確稱(chēng)取配體 0.140g(0.5mmol)于25mL燒杯中,加入10mL甲醇和5mL乙腈略微加熱溶解得橙黃色溶液。再稱(chēng)取CuCl2·2H2O 0.091g (0.5mmol)于50mL燒杯中,加入10mL甲醇溶解,待完全溶解后,將配體溶液逐滴滴入CuCl2溶液中得到黃綠色溶液,持續(xù)攪拌3天,有藍(lán)綠色粉末狀沉淀析出,過(guò)濾,洗滌,固體粉末烘干后呈藍(lán)綠色。

配合物[Ag(L)NO3](2)的合成方法與配合物(1)相似,但要避光攪拌3天,得粉色沉淀物。

1.3配體及配合物與DNA相互作用實(shí)驗(yàn)

采用已報(bào)道文獻(xiàn)[4-5]的經(jīng)典方法配制實(shí)驗(yàn)所需試劑、緩沖溶液以及進(jìn)行與DNA相互作用實(shí)驗(yàn)操作。DNA濃度對(duì)化合物的紫外吸收光譜和熒光吸收強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖2，3,化合物濃度對(duì)DNA黏度的影響見(jiàn)圖4。

1.4 配體及其配合物體外抗厭氧菌活性實(shí)驗(yàn)[6]

1.4.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株:變形鏈球菌(StreptococcusmutansUA159), 伴放線放線桿菌(ActinobacillusactinomycetemATCC 29523),均來(lái)自第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體實(shí)驗(yàn)室。

1.4.2實(shí)驗(yàn)方法

1) 培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

稱(chēng)取37g培養(yǎng)基,加入950mL的三蒸水,加熱溶解,再補(bǔ)水至1L,在121℃下高壓滅菌15min,冷卻至4℃保存。給所制備的1L培養(yǎng)液中加入15g瓊脂粉,充分溶解后,高溫高壓消毒15 min,再冷卻至50℃,取約20mL均勻地鋪于培養(yǎng)皿中,常溫下冷卻,并于4℃保存。

2) 抗菌活性檢測(cè)

取凍存的變形鏈球菌(S.mutans)和伴放線放線桿菌(A. a)分別劃線接種于培養(yǎng)基表面,進(jìn)行厭氧培養(yǎng);挑取培養(yǎng)36 h的S.mutans和培養(yǎng)48 h的A. a菌落各自接種于培養(yǎng)液,其中前者培養(yǎng)24 h,后者培養(yǎng)48 h,備用。用少量DMSO配制各種配體及其Cu，Ag配合物待測(cè)抗菌劑,用無(wú)菌水對(duì)各種抗菌劑從1 280 mg/L到0.625 mg/L進(jìn)行2倍梯度稀釋;96孔板的每孔中分別加入上述各種濃度的待測(cè)抗菌劑溶液、細(xì)菌培養(yǎng)液和BHI培養(yǎng)液,用酶標(biāo)儀進(jìn)行OD值測(cè)定。取對(duì)照組(每孔以 PBS緩沖溶液代替待測(cè)抗菌劑溶液,其余同前) 100μL,進(jìn)行10倍梯度稀釋,取100μL稀釋的菌液鋪于BHI培養(yǎng)基表面,培養(yǎng)48 h,得到每孔中原細(xì)菌生存數(shù)(同時(shí)對(duì)3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行計(jì)數(shù),取平均值)。再于厭氧箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后,繼續(xù)測(cè)定OD值,得到最小抑菌濃度(MIC)值。所有的試樣均平行測(cè)試3次,取平均值。

2結(jié)果與討論

2.1配合物的性質(zhì)表征

1) 配合物的元素分析和摩爾電導(dǎo)率

表1　配合物的元素分析及摩爾電導(dǎo)率

2) 配體及配合物的紅外光譜分析

表2　配體及配合物的紅外光譜數(shù)據(jù)(cm -1)

由表2可見(jiàn),配體形成各配合物后的特征吸收峰發(fā)生偏移的主要表現(xiàn)在咪唑環(huán)上的振動(dòng)吸收,其中的υC=N伸縮振動(dòng)都向低波數(shù)發(fā)生了偏移,說(shuō)明金屬與咪唑環(huán)上的3位N發(fā)生了配位[8]。配合物(2)存在含氧酸根NO3-,在譜圖上表現(xiàn)為4條譜帶,尤其是NO3-的N-O伸縮振動(dòng)峰在整個(gè)譜圖的吸收峰是最強(qiáng)的,其指紋區(qū)譜帶未增加,說(shuō)明NO3-未參與配位。

采用元素分析、紫外、紅外、電導(dǎo)率等方法,結(jié)合雙咪唑配合物文獻(xiàn)[9-10],初步推測(cè)各配合物的可能結(jié)構(gòu)為圖1所示。

圖1　配合物(1)，(2)的可能結(jié)構(gòu) Fig.1　The possible structure of the complexes

2.2配合物與ct-DNA相互作用研究

1) 配體及其配合物與DNA相互作用的紫外光譜分析

圖2為配體及其配合物(1)，(2)隨著DNA濃度增加與DNA相互作用的紫外吸收光譜圖。

曲線a→f DNA濃度(×10 -5mol/L)分別為: 0; 1.59; 3.16;4.71; 6.23; 7.74, 以下熒光圖同 圖2　DNA濃度對(duì)配體L及其配合物紫外光譜的影響 Fig.2　UV absorption spectra of L and its complexeswith increasing concentration of DNA

由圖2可以看到,雙咪唑硝基衍生物配體L及其銅配合物隨著DNA濃度的增加,其紫外特征吸收峰表現(xiàn)為減色效應(yīng),而它的銀配合物則表現(xiàn)為增色效應(yīng),最大吸收峰未發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移,與DNA相互作用模式應(yīng)該不是典型的插入作用[11]。根據(jù)減色率的大小,DNA對(duì)銅配合物的紫外光譜的影響比配體的紫外光譜影響要大。如果化合物小分子紫外-可見(jiàn)吸收光譜中的吸收峰強(qiáng)度表現(xiàn)為增色效應(yīng)或減色不顯著、無(wú)紅移現(xiàn)象,則認(rèn)為化合物小分子與DNA發(fā)生了非插入的靜電作用或溝槽作用[12]。

2) 配體及其配合物與DNA相互作用的熒光光譜分析。

圖3為配體及其配合物隨著DNA濃度增加與DNA相互作用的熒光吸收光譜圖。

圖3　DNA濃度對(duì)配體L及其配合物熒光光譜的影響 Fig.3　Fluorescence spectra of L and complexes at different concentrations of DNA

如圖3所示,隨著DNA濃度的不斷增加,配體及其配合物的熒光光譜強(qiáng)度都呈增加的趨勢(shì),但最大熒光吸收峰值變化不大,因此配體及其配合物與DNA的作用模式可能不是典型的插入式。根據(jù)增色率大小,配體及其銅配合物與DNA的作用力要強(qiáng),這與根據(jù)紫外吸收強(qiáng)度變化所得到的結(jié)論基本一致。

3) 配體及其配合物與 ct-DNA 相互作用的黏度分析

黏度法是研究化合物與DNA相互作用模式的另一種有效的檢測(cè)方法[13]。當(dāng)配合物插入DNA之間,黏度增加;與DNA以部分插入方式作用時(shí),DNA黏度變小;DNA溶液黏度變化不大,則與DNA以非插入方式作用[14-18]。如圖4所示,配體L及其銅配合物(1)使DNA溶液黏度減小,說(shuō)明配體L與DNA相互作用方式可能為部分插入;而其銀配合物(2)使DNA黏度變化不大,則可能是以非插入方式與DNA相互作用,這些結(jié)果與光譜分析的結(jié)果是一致的。

2.3配體及其配合物抗厭氧菌活性研究

對(duì)所合成的硝基雙咪唑衍生物配體及其Cu，Ag 配合物應(yīng)用變異鏈球菌(S. mutans)和伴放線放線桿菌(A. a)進(jìn)行抗菌活性試驗(yàn),測(cè)試結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明,參與抑菌實(shí)驗(yàn)的所有藥物對(duì)伴放線放線桿菌(A. a)的抑菌效果要強(qiáng)于變異鏈球菌(S. mutans)。配體L對(duì)兩種菌的抑菌效果都不如其配合物明顯,對(duì)變異鏈球菌(S. mutans)抑菌性(2)>(1),而對(duì)伴放線放線桿菌(A. a)的抑菌性(1)>(2)。

圖4　配體L及其配合物濃度對(duì)DNA黏度的影響 Fig.4　Effects of increasing amount of L and complexes on the viscosity of DNA

表3化合物對(duì)S. mutans UA 159和A. a ATCC 29523的最小抑菌濃度MIC值

Tab.3MIC of test material on S. mutans UA 159 and A. a ATCC 29523

測(cè)試樣MIC(S.mutans)/μg·mL-1MIC(A.a)/μg·mL-1L-320-160Ag配合物(2)40-2040-20Cu配合物(1)320-16020-10Ag+20-101.25-0.625Cu2+-20-10

硝基咪唑類(lèi)藥物發(fā)揮抗厭氧菌作用,是在細(xì)胞中的硝基還原酶的作用下,藥物的硝基還原成羥胺衍生物后,再與DNA作用引起鏈損傷、斷裂、解旋,導(dǎo)致細(xì)菌死亡[19-20]。依據(jù)硝基咪唑類(lèi)藥物的抗菌機(jī)制,可以認(rèn)為硝基咪唑類(lèi)藥物抗厭氧菌的最終主要細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)為DNA。分析配體及其配合物與DNA之間相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,其抗菌性與DNA相互作用結(jié)果并不完全一致,這是因?yàn)榻饘倥浜衔锏囊志鷻C(jī)理較復(fù)雜,包括干擾細(xì)胞的呼吸過(guò)程,破壞蛋白質(zhì)的合成,進(jìn)而抑制微生物的生長(zhǎng);正常的細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程受到配合物C=N基團(tuán)與細(xì)胞活性中心間所形成氫鍵的影響等等。因此，配合物的抗厭氧菌活性并不完全受該藥和DNA作用結(jié)果的影響。金屬配合物的抗厭氧菌機(jī)理,以及抗菌活性和配合物與DNA相互作用之間的關(guān)系,還需要進(jìn)一步分析研究。

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(編輯任智卉)