人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺結(jié)構(gòu)與功能的影響

·基礎(chǔ)研究·

人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺結(jié)構(gòu)與功能的影響

冉瑞圖孫嘉政張晶邵月張力恒李成鵬1賈道勇1張巖巖1張夢思1王亞平1

(重慶醫(yī)科大學(xué),重慶400016)

摘要〔〕目的探討人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺結(jié)構(gòu)與功能的影響及機制。方法SD大鼠隨機分為4組，每組10只。衰老模型組，皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，1次/d，42 d；Rg1衰老模型組，注射D-半乳糖劑量與時間同衰老模型組，第15天起腹腔注射Rg1 20 mg/kg，1次/d，28 d正常對照組，皮下注射生理鹽水1次/d，42 d；Rg1正常對照組，注射生理鹽水1次/d，14 d，第15天起腹腔注射Rg1(同Rg1衰老模型組)。模型復(fù)制或藥物注射完成后第2天，取胸腺測定胸腺指數(shù)，石蠟切片觀察胸腺形態(tài)學(xué)；衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色檢測胸腺細胞衰老，CCK-8檢測胸腺細胞對刀豆蛋白A刺激的增殖能力，ELISA檢測胸腺細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α、GM-CSF、白細胞介素(IL)-2與IL-6的能力，流式細胞術(shù)檢測細胞活性氧(ROS)、胸腺細胞凋亡，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)，酶學(xué)檢測超氧化物歧化酶(SOD)，DTNB法測定谷胱甘肽(GSH)、氧化谷胱甘肽(GSSG)含量，Western 印跡檢測細胞衰老相關(guān)蛋白p21、p53、Rb的變化。結(jié)果Rg1衰老模型組大鼠胸腺指數(shù)升高、胸腺皮質(zhì)面積比例增加、胸腺細胞的增殖能力提高，凋亡率減少、SA-β-Gal陽性胸腺細胞百分率下降、TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-6的分泌能力明顯提高、SOD活性明顯提升；ROS和MDA含量下降；p53、p21、Rb蛋白表達有顯著下調(diào)。結(jié)論D-半乳糖復(fù)制的衰老模型大鼠胸腺結(jié)構(gòu)與功能損傷明顯，人參皂苷Rg1對其致衰損傷有明確的保護作用，其機制可能與抑制氧化損傷和下調(diào)p16-Rb、p53/p21信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕人參皂苷Rg1；胸腺

中圖分類號〔〕R329.5〔

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(30973818)；國家教育部博士導(dǎo)師基金(20125503110006)；重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新基金(201314)

通訊作者：王亞平(1956-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事干細胞衰老研究。

Effect of Ginsenoside Rg1 on the thymus structure and function of aging model rats

RAN Rui-Tu,SUN Jia-Zheng,ZHANG Jing,etal.

Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the thymus structure and function of aging model rats and its relative mechanism. Methods40 SD rats were randomly divided into normal control,Rg1 control,aging model and Rg1 aging model groups. After 2 days of finishing injections,the thymus index was measured,paraffin section were made to observe thymus microscopic structure. Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) stain was used to detect aging thymocytes. The proliferative capacity of thymocytes stimulated with Concanavalin A (Con A) was measured by CCK-8.The contents of TNF -α,GM-CSF,IL-2 and IL-6 were detected by ELISA. The apoptosis of thymocytes and level of reactive oxygen species(ROS)were analyzed by flow cytometry(FCM). The content of malondialdehyde(MDA) was detected by thiobarbituric acid method,the level of superoxide dismutase (SOD) was detected by enzymatic assay. The expressions of GSH,GSSG were detected by DTNB method. The expressions of senescence-associated protein P53,P21,Rb were detected by Western blot. ResultsComparing with those of Rg1 aging model group,the thymus index,thymus cortex area proportion,the secretory capability of IL-2,TNF-α,GM-CSF,and IL-6,the active content of SOD were obviously increased. The percentage of SA-β-Gal positive thymocytes,apoptosis rate of thymocytes,the production of ROS,MDA were significantly decreased,the expressions of P53,P21,Rb were also significantly down-regulated. ConclusionsThe thymus structure and function are obviously induced senescence by treating with D-galactose,ginsenoside Rg1 has a significantly antiaging or protective effect on thymus injury.The mechanism may be Rg1 inhibiting oxidative stress and down-regulating p53/p21/Rb signaling pathway

【Key words】Ginsenoside Rg1; Thymus

1重慶醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室

第一作者：冉瑞圖(1992-)，男，臨床醫(yī)學(xué)七年制在讀學(xué)生，主要從事干細胞衰老研究。

免疫系統(tǒng)衰退將導(dǎo)致機體免疫功能低下、組織器官損傷修復(fù)障礙、自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)生率提高等相關(guān)疾病。祖國醫(yī)學(xué)的 “氣血理論”認為,正氣是具有防御、修復(fù)損傷等功能的有形物質(zhì),可見，“氣”與機體免疫功能密切相關(guān)。人參是中醫(yī)臨床“補氣”要藥，人參皂苷Rg1是人參重要的抗衰老成分。我們最近研究證明，人參皂苷Rg1可調(diào)控造血干細胞衰老〔1,2〕。推測人參皂苷Rg1可以調(diào)控或激活免疫系統(tǒng)功能。胸腺是機體的中樞免疫器官，在T細胞的培育中起到舉足輕重的作用。本文探討人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺結(jié)構(gòu)與功能的影響及其機制，旨在闡釋衰老機體免疫功能低下機制。

1材料與方法

1.1實驗動物3月齡清潔級雄性SD大鼠40只，體重180～200 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供〔合格證號SCXK(渝2007-0001)〕。飼養(yǎng)條件控制在20℃～25℃，自然照明，自由飲水和攝食。

1.2主要試劑人參皂苷Rg1(吉林宏久生物技術(shù)有限公司購買，純度≥98.6%)；D-半乳糖、刀豆蛋白(Con)A(Sigma公司)；白介素(IL)-2、IL-6 、腫瘤壞死因子(TNF)-α、GM-CSF檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；0.25%胰酶-EDTA、胎牛血清(Hyclon公司)；CCK-8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物公司)；活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Cal)試劑盒(碧云天公司)； p53、p21、RB兔抗鼠多克隆抗體(Prointech公司)；羊抗兔二抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3大鼠衰老模型復(fù)制與給藥〔3〕SD大鼠隨機分4組，每組10只。衰老模型組，皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，1次/d，42 d；Rg1衰老模型組，注射D-半乳糖劑量與時間同衰老模型組，第15天起腹腔注射Rg1 20 mg mg/kg，1次/d，28 d；正常對照組，注射等量生理鹽水1次/d，28 d；Rg1正常對照組，注射等量生理鹽水1次/d，42 d，第15天起腹腔注射Rg1(同Rg1衰老模型組)。

1.4胸腺指數(shù)測定與顯微形態(tài)學(xué)觀察模型復(fù)制或藥物注射完成后第2天稱各組大鼠體重(kg)，取出胸腺稱濕重(mg)，測定胸腺指數(shù)(胸腺指數(shù)=胸腺濕重/體重)。取各組大鼠胸腺，4%多聚甲醛固定胸腺2 d，常規(guī)石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察連續(xù)切片，以Image J 軟件計算胸腺皮質(zhì)占胸腺組織切片的比例。

1.5SA-β-Gal酶染色檢測胸腺細胞衰老情況制備胸腺冷凍組織切片，SA-β-Gal酶染色固定液固定15 min,PBS液洗滌3次，加SA-β-Gal染色液，置37℃培養(yǎng)箱中孵育12～16 h,顯微鏡下觀察著藍色陽性細胞，計算各組大鼠衰老胸腺細胞百分比。

1.6胸腺細胞對ConA刺激的增殖能力研磨各組胸腺，通過400目銅網(wǎng)濾過胸腺殘余組織，制備胸腺細胞懸液。將懸液移至離心管中,1 000 r/min×5 min， PBS重懸細胞,加淋巴細胞分離液分離計數(shù)胸腺細胞。按每孔5×103細胞 /200 μl 接種于96孔板中，每孔加終濃度5 μg/ml的ConA，每組設(shè)置5個復(fù)孔，設(shè)立空白對照孔調(diào)零。分別培養(yǎng)0、1、2、3、4 d，各孔加10 μl CCK-8，酶標儀(450 nm波長)測定吸光度值(A值)，評價胸腺細胞對ConA刺激的增殖能力。

1.7ELISA檢測胸腺細胞分泌TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-6的能力按1.6方法制備和計數(shù)胸腺細胞，調(diào)整細胞濃度后接種于12孔板中，每孔加2 ml細胞懸液(含2×106個胸腺細胞),同時加入終濃度為5 μg/ml的ConA，培養(yǎng)48 h,離心收集培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書檢測各組培養(yǎng)上清中IL-2、IL-6、TNF-α、GM-CSF含量。

1.8細胞氧化及抗氧化能力檢測收集1.6制備的各組胸腺細胞，加入1 ml的DCFH-DA于各組胸臟細胞培養(yǎng)瓶中，37℃ 孵育 25 min，培養(yǎng)液洗滌細胞3次，流式細胞術(shù)檢測胸腺細胞內(nèi)ROS水平，以 DCF 的平均熒光強度表示其含量。收集細胞培養(yǎng)上清液，黃嘌呤氧化酶學(xué)法檢測SOD，硫代巴比妥酸比色法檢測MDA的含量，DTNB法測定谷胱甘肽(GSH)、氧化谷胱甘肽(GSSG)含量。

1.9胸腺細胞凋亡比例檢測收集實驗1.6培養(yǎng)的胸腺細胞,用預(yù)冷的 PBS 洗滌細胞 2次,調(diào)整細胞濃度為1×106/ml,加入AnnexinV -FITC 和50 μg/ml PI,搖勻后室溫避光放置15 min,加入緩沖液后上流式細胞儀(Becton Dickinson，USA)檢測，計算機分析胸腺細胞凋亡數(shù)據(jù)。

1.10衰老相關(guān)蛋白檢測提取各組胸腺細胞總蛋白，調(diào)整蛋白濃度40 μg/泳道，12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗p53、p21、Rb(均1∶200)、β-actin抗體(1∶4 000)4℃孵育過夜，洗膜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜，ECL發(fā)光系統(tǒng)顯色。用FluorSTM Multimager 圖像分析儀，Quality-One4.11軟件進行圖像灰度掃描處理。

2結(jié)果

2.1人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺指數(shù)與組織形態(tài)學(xué)的影響衰老模型組胸腺指數(shù)明顯下降，Rg1衰老模型組胸腺指數(shù)顯著增加，見表1。衰老模型組胸腺皮質(zhì)變薄，皮質(zhì)與髓質(zhì)比例(6.8±0.9)明顯減少；Rg1衰老模型組大鼠胸腺皮質(zhì)增厚，皮質(zhì)與髓質(zhì)比例(7.5±1.2)明顯增加，見圖1。正常對照組與Rg1對照組胸腺皮髓質(zhì)比例分別為9.2±1.2，10.1±1.5。

表1　人參皂苷Rg1對大鼠重量和胸腺指數(shù)的影響 ± s, n=10)

與正常對照組比較:1)P<0.05；2)P<0.01;與衰老模型組比較:3)P<0.05,4)P<0.01

圖1　人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺組織形態(tài)的影響(HE染色，×200)

2.2人參皂苷Rg1對衰老大鼠SA-β-Gal陽性胸腺細胞影響胸腺細胞胞質(zhì)呈藍色為SA-β-Gal陽性細胞，著色深淺及著色面積與胸腺細胞衰老程度呈正相關(guān)。衰老模型組陽性細胞數(shù)顯著增多〔(41.0±2.74)%〕，Rg1正常對照組SA-β-Gal陽性率為(21.8±2.58)%。對照組陽性細胞較少〔(19.0±3.54)%〕； Rg1衰老模型組陽性細胞數(shù)明顯減少〔(28.1±1.58)%〕，提示Rg1能顯著抑制衰老大鼠胸腺細胞的衰退。見圖2。正常對照組SA-β-Gal陽星率為(21.8±2.58)%。

2.3人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞增殖反應(yīng)的影響衰老模型組大鼠胸腺細胞對絲裂原ConA的增殖反應(yīng)能力明顯降低， Rg1衰老模型組大鼠胸腺細胞對ConA增殖反應(yīng)能力增強。見圖3。

圖2　人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞衰老影響(SA-β-Gal染色，×400)

與正常對照組比較:1)P<0.05；與衰老模型組比較:2)P<0.05 圖3　人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞增殖反應(yīng)的影響

2.4人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞分泌TNF-α、GM-CSF、IL-2、 IL-6水平的影響衰老模型組胸腺細胞分泌TNF-α、GM-CSF、IL-2、 IL-6水平明顯降低；Rg1衰老模型組胸腺細胞分泌IL-2、 IL-6水平顯著上升、TNF-α、GM-CSF水平有所提高。見圖4。

與正常對照組比較：1)P<0.01；與衰老模型組比較：2)P<0.05 圖4　人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞分泌細胞因子 水平的影響

2.5人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞產(chǎn)生ROS、SOD、MDA水平的影響衰老模型組大鼠胸腺細胞產(chǎn)生ROS水平明顯升高，MDA含量顯著升高，SOD 活性顯著下降，GSH/GSSH明顯降低；Rg1衰老模型組大鼠胸腺細胞產(chǎn)生ROS水平明顯降低，SOD 活性顯著升高，MDA含量顯著下降，GSH/GSSH升高。見表2，表3。

表2　人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞產(chǎn)生ROS、

與正常對照組比較：1)P<0.01；與衰老模型組比較：2)P<0.01,3)P<0.05

表3　人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞

與正常對照組比較:1)P<0.01；與衰老模型組比較:2)P<0.05

2.6人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞凋亡的影響衰老模型組大鼠胸腺細胞凋亡率〔(31.4±1.24)%〕明顯升高，Rg1衰老模型組大鼠胸腺細胞凋亡率〔(28.6±3.03)%〕下降。正常對照組及Rg1對照組胸腺細胞凋亡率分別為(22.0±1.5)%及(16.9±1.61)%。

2.7人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞表達p21、p53、Rb蛋白的影響正常對照組胸腺細胞p21、p53、Rb蛋白低表達，衰老模型組大鼠胸腺細胞衰老相關(guān)蛋白p21、p53、Rb表達上調(diào)，Rg1對照組胸腺細胞中p21、p53、Rb蛋白表達量顯著降低。衰老模型組p21、p53、Rb蛋白表達與正常對照組細胞相比明顯升高，與Rg1衰老模型組胸腺細胞中p21、p53、Rb蛋白表達量比較有所降低，見表4，圖5。

表4　人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞p53、p21、Rb

與正常對照組比較:1)P<0.05；與衰老模型組比較:2)P<0.05

1.正常對照組;2.Rg1對照組;3.衰老模型組;4.Rg1衰老模型組 圖5　人參皂苷Rg1對衰老大鼠胸腺細胞表達 p53、p21、Rb蛋白的影響

3討論

D -半乳糖是目前公認的致衰劑，可以用于動物衰老模型的復(fù)制〔4〕。本研究采用D -半乳糖皮下注射42 d成功復(fù)制大鼠衰老模型，衰老模型大鼠胸腺重量，胸腺指數(shù)、胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)的面積比例、胸腺細胞對ConA的增殖反應(yīng)均明顯下降，胸腺細胞分泌TNF-α、GM-CSF、IL-2，IL-6能力顯著下降，胸腺細胞SA-β-Gal染色陽性率以及凋亡率增加，結(jié)果提示，D -半乳糖建立的衰老動物模型可導(dǎo)致大鼠胸腺結(jié)構(gòu)與功能損傷，可用于免疫器官衰退相關(guān)生物學(xué)研究。

胸腺重量和胸腺指數(shù)是代表胸腺大體形態(tài)的重要指標，胸腺皮質(zhì)是胸腺組織學(xué)的實質(zhì)結(jié)構(gòu)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)能反映器官的機能狀態(tài)。我們在復(fù)制衰老大鼠模型時，從第15天起給大鼠腹腔注射Rg1干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射Rg1能明顯減輕衰老模型大鼠胸腺萎縮程度，提高胸腺指數(shù)和胸腺皮質(zhì)面積比例，提示Rg1能拮抗D-半乳糖對胸腺結(jié)構(gòu)的破壞，可用于臨床保護和延緩免疫器官衰老。

胸腺是T細胞分化、發(fā)育、成熟的場所，研究胸腺細胞的功能狀態(tài)是反映胸腺功能的直接證據(jù)。本研究結(jié)果表明，Rg1能阻止D -半乳糖誘導(dǎo)的胸腺細胞衰老，并能促進胸腺細胞增殖和激活胸腺細胞功能。

氧化應(yīng)激衰老機制認為，細胞內(nèi)ROS水平增加和抗氧化能力下降是導(dǎo)致細胞衰老的關(guān)鍵因素〔5〕。ROS一方面可攻擊細胞膜中的多不飽和脂肪酸，形成過氧化脂質(zhì)；另一方面可作為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達調(diào)控分子，對細胞增殖分化、細胞凋亡和細胞衰老具有調(diào)控作用。機體中SOD能有效清除生物氧化產(chǎn)生的超氧陽離子自由基。本實驗結(jié)果證明，給衰老模型組大鼠注射Rg1，發(fā)現(xiàn)胸腺細胞產(chǎn)生ROS和MDA水平明顯減少，SOD的活性和GSH/GSSG比例顯著上升，提示Rg1可能通過抑制D-半乳糖所致的氧化損傷，進而延緩大鼠胸腺衰老。

p53-p21-Rb是重要的細胞衰老信號傳導(dǎo)通路， p53蛋白參與細胞對DNA損傷的應(yīng)答，在維持基因組的穩(wěn)定性中起“分子警察”作用〔6〕。p53的激活可上調(diào)p21的表達，從而抑制CDK2/Cyclin E復(fù)合物的活性，進而阻止細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變〔7〕。p21還可通過抑制細胞CDK活性，從而抑制Rb和轉(zhuǎn)錄因子(E2F)的磷酸化過程，進而誘導(dǎo)細胞的生長停滯。本實驗發(fā)現(xiàn)，衰老模型組大鼠胸腺細胞p53、p21、Rb蛋白表達增加。注射人參皂苷Rg1能顯著降低衰老模型組大鼠胸腺細胞p53、p21、RB蛋白的表達。推測Rg1可以下調(diào)p53-p21-Rb衰老信號通路，這可能是Rg1延緩大鼠胸腺衰老或損傷機制之一。

4參考文獻

1周玥,楊斌,姚欣,等.人參皂苷Rg-1延緩造血干細胞衰老與p16～(INK4a)表達關(guān)系的研究〔J〕.中國中藥雜志,2011；36(5):608-13.

2崔巍，趙洪艷，王燕嬉.人參皂甙抗衰老的研究進展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2006；26(17)：1578-81.

3彭彬,陳茂山,蒲瑩,等.人參皂苷Rg1延緩D-半乳糖大鼠腦衰老作用及機制的初步研究〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011；4:419-22.

4Gorczynski RM,Terzioglu E.Aging and the immune system〔J〕.Int Urol Nephrol,2008；40(4):1117-25.

5Droge W.Free radicals in the physiological control of cell function〔J〕.Physiol Rev,2002；82(1):47-95.

6Chen X,Zhang W,Gao Y,etal.Senescence-like changes induced by expression of p21(waf1/cip1)in NIH3T3 cell line〔J〕.Cell Res,2002；12(3-4):229-33.

7Jackson JG,Pereira-Smith OM.p53 is preferentially recruited to the promoters of growth arrest genes p21 and GADD45 during replicative senescence of normal human fibroblasts〔J〕.Cancer Res,2006;66(17):8356-60.

〔2014-11-19修回〕

(編輯李相軍)

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1)美國化學(xué)文摘(CA)，CODEN ZLZHAO，http://www.lib.dlut.edu.cn/layersec.asp；

2)波蘭《哥白尼索引》(IC, Index of Copernicus), http://journals.indexcopernicus. com/karta. Php;

3)日本《科學(xué)技術(shù)社(中國文獻數(shù)據(jù)庫)》(JST, Japan Science & Technology Agency) (Chinese Bibliographic Database);

4)美國《烏利希期刊指南》(UPD,Ulrich′s Periodicals Directory), http://www. ulrichsweb. com/ ulrichsweb/