貴州漢族老年人群載脂蛋白A5基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性

貴州漢族老年人群載脂蛋白A5基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性

黃健黃韻祝楊國珍1蹇孝麗方禮琳

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生化科，貴州貴陽550004)

摘要〔〕目的探討載脂蛋白A5(ApoA5)基因-1131T>C及56C>G基因多態(tài)性與貴州漢族老年人群2型糖尿病(T2DM)及體內(nèi)血脂水平的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測100例健康人及142例T2DM患者ApoA5-1131T>C、56C>G基因型，并統(tǒng)計(jì)等位基因頻率分布情況，同時(shí)測定所有對象的血脂、血糖水平。結(jié)果①T2DM組和對照組的ApoA5-1131T>C位點(diǎn)基因型頻率比較差異顯著(P=0.006)，等位基因頻率比較無差異(P=0.349)；②對照組和T2DM組的ApoA5-1131C等位基因(TC+CC)攜帶者的甘油三酯(TG)均明顯高于非C等位基因攜帶者(TT)(P<0.05)；③未發(fā)現(xiàn)ApoA5基因56C>G基因多態(tài)性。結(jié)論ApoA5-1131T>C基因多態(tài)性與貴州漢族老年人群T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，攜帶C等位基因的人群發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高，且C等位基因與TG水平增高有關(guān)；未檢測出ApoA5基因56C>G基因多態(tài)性。

關(guān)鍵詞〔〕載脂蛋白A5基因；單核苷酸多態(tài)性(SNP)；2型糖尿病(T2DM)

中圖分類號〔〕R446.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家級教學(xué)團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)基金(教高函〔2009〕18號)；貴州省2014年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410660016)

通訊作者：黃韻祝(1957-)，女，教授，主要從事血脂生化相關(guān)研究。

1貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院

第一作者：黃健(1981-)，男，副主任技師，主要從事血脂生化相關(guān)研究。

老年糖尿病以2型糖尿病(T2DM)居多，脂代謝異常在T2DM患者中表現(xiàn)突出，血漿甘油三酯(TG)升高是T2DM患者血脂代謝異常的主要特征之一〔1，2〕。研究表明，人類載脂蛋白A5(ApoA5)基因的單核苷酸突變(SNPs)對人群的TG含量有顯著影響，其中ApoA5-1131T>C及56C>G兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性對血漿TG水平的影響較大〔3〕。由于基因多態(tài)性分布存在種族差異，本研究探討ApoA5基因-1131T>C及56C>G基因多態(tài)性與貴州漢族老年人群2型糖尿病及體內(nèi)血脂水平的關(guān)系。

1材料與方法

1.1研究對象納入無親緣關(guān)系的T2DM患者142例，其中男55例，女87例，平均年齡(62.00±7.68)歲，均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有病例均為貴州地區(qū)漢族人群，選自流行病學(xué)調(diào)查人群。同時(shí)選擇血脂及血糖正常者100例作為對照組，男36例，女64例，平均年齡(60.8±8.15)歲，排除心、肺、肝、腎及內(nèi)分泌疾病，全選自貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心，均為貴州地區(qū)漢族人群。

唐玉煙目光中泛起一絲惆悵，她望著洞外陣陣翻騰的云霧一陣失神，半晌才道：“其實(shí)，我是唐門副門主唐琮的親傳弟子。唐門是巴州第一豪族大派，表面看上去風(fēng)光無限，但實(shí)際上，內(nèi)部卻是沖突不斷。在高層之間，更是分化成了以門主唐烈為首的激進(jìn)派和以副門主唐琮為首的保守派。唐烈野心勃勃，一心想稱霸中州，唐琮則認(rèn)為，稱霸之事必會(huì)給唐門帶來災(zāi)禍，是以極力反對。二人誰也奈何不得對方，兩派陷入久持。

為了采摘方便，采用寬窄行種植采摘更方便，即采用1.2 m地膜，1膜4行，膜上行距30.0 cm，膜間行距60.0 cm，株距25.0 cm。寬窄行條播種植的特點(diǎn)，在田間栽培管理上便于中耕除草、灌溉等，利于摘花，節(jié)約種子，寬窄行條播種植還有利于進(jìn)行間套種，以解決前后茬作物的季節(jié)矛盾[12]。

2.4ApoA5基因-1131T>C位點(diǎn)不同基因型研究對象血脂水平在對照組中，C等位基因攜帶者TG較非C等位基因攜帶者明顯升高(P=0.02)，T2DM組中，C等位基因攜帶者TG水平亦明顯高于非C等位基因攜帶者(P=0.01)；而TC、LDL-C、HDL-C在C等位基因與非C等位基因組間比較沒有明顯差異(P>0.05)。見表2。

1.3外周血基因組DNA提取抽取外周靜脈血2 ml，EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)抗凝用于提取基因組DNA。按亞能生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒說明書抽提基因組DNA。取5 μl基因組DNA與1 μl 6倍上樣緩沖液點(diǎn)樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，90 V電壓電泳60 min。在凝膠成像儀上觀察所提取的基因組DNA的亮度及純度(此試劑盒提取的DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳有一條清晰的約20 kb的DNA條帶)。

取證工作錄音錄像制度最重要的是對訊問過程進(jìn)行錄音錄像。從《監(jiān)察法》的表述來看，訊問是錄音錄像最主要的對象，該法要求對訊問一律錄音錄像，不存在例外情況?！缎淌略V訟法》要求錄音錄像制度適用的范圍也是訊問犯罪嫌疑人的過程。對訊問進(jìn)行錄音錄像主要是為了固定被告人的供述，防止其翻供。之前許多被告人在偵查階段訊問中承認(rèn)犯罪，但到了庭審中又當(dāng)庭翻供，否認(rèn)先前做過有罪供述，或者聲稱辦案機(jī)關(guān)采取刑訊逼供、威脅、引誘、欺騙等方法獲取其有罪供述。此時(shí)就需要通過錄音錄像還原訊問過程，證明供述真實(shí)性、取證合法性等事實(shí)，其他材料例如訊問筆錄、健康體格檢查報(bào)告等都無法達(dá)到錄音錄像的效果。

1.4ApoA5-1131T>C、56C>G位點(diǎn)的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析

在進(jìn)行ApoA5基因56C>G基因多態(tài)性研究中，只檢測出CC一種基因型，沒有發(fā)現(xiàn)其他基因型，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，也無法分析這一位點(diǎn)與T2DM及血脂的關(guān)系，原因可能是標(biāo)本量不足而使得該存在的差異沒有表現(xiàn)出來。丁妍等〔12〕在對257名湖北省漢族人群56C>G位點(diǎn)研究中得出G等位基因頻率小于1%，其認(rèn)為ApoA5基因 56C>G是一個(gè)突變點(diǎn)而不是一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。在國外的一些研究結(jié)果表明〔13〕，這一稀有位點(diǎn)純合攜帶者的TG水平比野生型明顯增高。由于本次實(shí)驗(yàn)的樣本量少，這個(gè)位點(diǎn)到底是突變點(diǎn)還是多態(tài)位點(diǎn)，需進(jìn)一步證實(shí)。

1.4.2ApoA5-1131T>C位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切取出現(xiàn)清晰的特異性條帶PCR產(chǎn)物，以MseⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化(37℃水浴4 h)。酶切反應(yīng)體系如下(20 μl)：10倍緩沖液2 μl，BSA 0.2 μl，MseⅠ0.5 μl，PCR產(chǎn)物8 μl，雙蒸水補(bǔ)足體積。酶切產(chǎn)物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，80 V電壓電泳2 h，在凝膠成像儀上觀察并攝像。

1.4.356C>G位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切取出現(xiàn)清晰的特異性條帶PCR產(chǎn)物，以TaqⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化(65℃水浴2 h)。酶切反應(yīng)體系如下(10 μl)：10倍緩沖液1 μl，BSA 1 μl，TaqⅠ0.5 μl，PCR產(chǎn)物8 μl，雙蒸水補(bǔ)足體積。酶切產(chǎn)物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，80 V電壓電泳2 h，在凝膠成像儀上觀察并攝像。

2結(jié)果

2.1ApoA5基因-1131T>C、56C>G基因多態(tài)性檢測結(jié)果

2.1.1ApoA5基因-1131T>C位點(diǎn)PCR酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果-1131T>C位點(diǎn)位于ApoA5基因啟動(dòng)子區(qū)域，酶切產(chǎn)物電泳后可出現(xiàn)三種情況：133 bp和21 bp兩條帶的為TT野生型純合子；只有154 bp一條帶的為CC突變型純合子；有154 bp，133 bp和21 bp三條帶的為TC型雜合子(圖1)。

技術(shù)要領(lǐng)指導(dǎo)：兩臂保持分開，呈半弧形，在面對傳球的時(shí)候，主動(dòng)前迎。進(jìn)行伸臂，同時(shí)保持身體的適當(dāng)前傾，接球引胸前。

2.1.2ApoA5基因56C>G位點(diǎn)PCR酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果ApoA5基因56C>G位點(diǎn)酶切產(chǎn)物有三種基因型：134 bp和23 bp兩條帶的為CC野生型純合子；只有157 bp一條帶的為GG突變型純合子；有157 bp，134 bp和23 bp三條帶的為CG型雜合子(圖2)。

2.2ApoA5基因56C>G位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布情況ApoA5基因56C>G位點(diǎn)位于ApoA5基因第二外顯子，PCR產(chǎn)物長度157 bp，TaqⅠ酶切電泳結(jié)果(圖2)。本研究中僅檢

測出CC一種基因型。

ApoA5基因是在2001年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的載脂蛋白基因，研究表明，人類ApoA5基因的SNPs對人群的TG含量有顯著影響，而ApoA5調(diào)節(jié)TG的作用機(jī)制目前仍在研究當(dāng)中〔5，6〕。可能是通過增強(qiáng)脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性，抑制ApoB和ApoC3的作用，加速血漿VLDL的清除來降低TG。很多患者在糖代謝異常之前就已經(jīng)出現(xiàn)了脂代謝紊亂，常見血TG升高。San等〔7〕對6個(gè)家族性高甘油三酯血癥(HTG)家系患者進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)這類家系中T2DM的發(fā)病率明顯增加，認(rèn)為空腹血TG水平增高是發(fā)生T2DM的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。

1.2血漿脂類水平及血糖的檢測用生化管抽取所有研究對象早晨空腹外周血5 ml，室溫下3 000 r/min離心5 min，取上層血清使用奧林巴斯5400全自動(dòng)生化分析儀測定血脂代謝及血糖相關(guān)指標(biāo)。

在該翻轉(zhuǎn)裝置的受力情況下，運(yùn)用經(jīng)典力學(xué)理論對設(shè)計(jì)的夾具進(jìn)行了校核設(shè)計(jì)，并且運(yùn)用有限元分析手段，對薄弱的零部件進(jìn)行了靜態(tài)強(qiáng)度分析。最終，通過試驗(yàn)驗(yàn)證了設(shè)計(jì)的可行性。

1～5：CC基因型 圖2　ApoA5基因56C>G位點(diǎn)限制性片段長度多態(tài)性分析

組別n基因型頻率TTTCCC等位基因頻率TC對照組10051(51.0)33(33.0)16(16.0)135(67.5)65(32.5)T2DM組14252(36.6)76(53.5)1)14(9.9)180(63.4)104(36.6)

與對照組比較：1)P<0.01

表2　ApoA5基因-1131T>C位點(diǎn)不同基因型的血脂水平比較

與對照組TT比較：1)P<0.05；與T2DM組TT比較：2)P<0.05

3討論

2.3ApoA5基因-1131T>C位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在T2DM組及對照組中分布兩組人群ApoA5基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。T2DM組的TC型基因型頻率顯著高于對照組(P=0.006)。見表1。

臨床研究證實(shí)，ApoA5基因多態(tài)性與代謝綜合征和血糖代謝異常存在相關(guān)性，而在其具體機(jī)制上，除去經(jīng)由血脂相關(guān)的作用途徑外，是否還額外存在其他獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)，目前仍存在爭議。本研究發(fā)現(xiàn)對照組與2型糖尿病組人群的ApoA5-1131T>C位點(diǎn)基因型頻率比較有顯著性差異，與血脂關(guān)系的研究顯示對照組和T2DM組的C等位基因(TC+CC)攜帶者的TG均明顯高于非C等位基因攜帶者(TT)。此結(jié)果與國內(nèi)翟光華等〔8〕對ApoA5基因多態(tài)性與中國鎮(zhèn)江地區(qū)T2DM的相關(guān)性研究的研究結(jié)果相似，提示ApoA5-1131C等位基因可能與T2DM的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。但肖輝等〔9〕對ApoA5-1131T>C基因多態(tài)性與維吾爾族T2DM的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)ApoA5-1131C基因多態(tài)性與新疆維吾爾族的T2DM的發(fā)生并不具有相關(guān)性，但與TG水平相關(guān)。以上研究結(jié)果的差異可能是與試驗(yàn)方法及研究的對象不同有關(guān)系，也可能提示ApoA5-1131T>C基因多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性可能具有人群異質(zhì)性，要揭示其具體關(guān)系尚需更大樣本量研究。同時(shí)本研究顯示貴州地區(qū)漢族人群的ApoA5基因-1131C等位基因頻率為32.5%，與日本人相似，高于西方人，這與國內(nèi)的一些研究結(jié)果也相符〔10，11〕。說明C等位基因在亞洲人群中更為常見，這可能是不同的人種和民族，其遺傳背景、生存環(huán)境等多重因素共同影響的結(jié)果。

1.4.1PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)〔4〕如下：-1131T>C位點(diǎn)上游5′GGAGCTTGTGAACGTGTGTATGAGT3′，下游5′CCCCAGGAACTGGAGCGAAATT3′。56C>G位點(diǎn)上游5′GGCTCTTCTTTCAGGTGGGTCTCCG3′，下游5′GCCTTTCCGTGC CTGGGTGGT3′。由寶生物工程有限公司合成，原液配制成10 μmol/L的溶液備用。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μl)：包括Premix Taq 12.5 μl，模板DNA 3 μl，上下引物各0.3 μl，雙蒸水補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，59℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物5 μl用2%的瓊脂糖凝膠中電泳(90 V 40 min)，在凝膠成像儀上觀察并攝像，結(jié)合DNA Marker判斷是否為目的DNA。

Pim-1蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞漿中，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞核中，表現(xiàn)為棕黃色或深棕色的顆粒沉積(圖1)。122例癌組織、相對應(yīng)的癌旁組織及85例正常肝組織中，Pim-1的總陽性表達(dá)率分別為88.5%、73.0%、69.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.2530，P=0.0013)。與癌旁組織及正常肝組織比較，癌組織中Pim-1蛋白的總陽性率顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)；但癌旁組織和正常肝組織中的總陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。提示Pim-1蛋白在PHC組織中的表達(dá)量顯著升高，其總陽性率為PHC組織>癌旁組織>正常肝組織。

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當(dāng)今社會(huì)石油產(chǎn)品供應(yīng)越來越緊張，天然氣放空造成了極大的浪費(fèi)和環(huán)境污染，加之環(huán)保意識的增強(qiáng)和能源可持續(xù)發(fā)展的要求，放空天然氣回收工作越來越受到重視[1]。冀東油田、勝利油田、大港油田等各大油田公司較早就對天然氣放空的問題非常重視，組織開展了放空天然氣的回收規(guī)劃設(shè)計(jì)工作，并逐步實(shí)施[2]。目前各油田公司所使用的天然氣回收利用技術(shù)主要有CNG技術(shù)和脫烴工藝技術(shù)等，CNG技術(shù)主要是通過將天然氣進(jìn)行脫水之后而被壓縮至20 MPa，然后將其充入至專門的CNG拖車之中；脫烴工藝技術(shù)主要是外冷脫烴和膨脹制冷脫烴[3]；表1比對分析了5種放空回收方法[4-9]。表2對比了國內(nèi)外高壓氣田放空天然氣回收現(xiàn)狀。

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1.3.2 樣品前處理 除去樹莓果實(shí)中的雜質(zhì)，勻漿后烘干。準(zhǔn)確稱量樹莓果實(shí)粗粉20.00 g，包入濾紙中放于提取器內(nèi)，60℃下甲醇提取4 h后收集提取液。甲醇提取液在50℃以下真空蒸發(fā)回收溶劑后，甲醇提取物以1.00 g甲醇提取物加100 mL 10%甲醇的比例溶解，再以乙醚萃取3次(液比1∶3)，合并乙醚萃取液，蒸發(fā)溶劑得到紅棕色油狀浸膏1.00 g。

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2018年以來，中國家電市場整體面臨的壓力較大，從下圖中的數(shù)據(jù)我們可以看出，2017年全年，中國家電市場零售額增速為11.8%，而2018年截至11月份，增速只有1.6%，大約只有去年全年增速的七分之一，今年的中國家電零售業(yè)可能將迎來整體“失速”的危機(jī)。

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〔2014-03-11修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)