多烯紫杉醇對(duì)人食管癌EC-109細(xì)胞增殖及凋亡的影響

多烯紫杉醇對(duì)人食管癌EC-109細(xì)胞增殖及凋亡的影響

趙艷平楊春旭1

(呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古牙克石021000)

摘要〔〕目的探討多烯紫杉醇對(duì)食管癌EC-109細(xì)胞株增殖、凋亡的影響。方法采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞生長的抑制作用，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，Western印跡法測(cè)定多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞蛋白激酶B(Akt)-1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果多烯紫杉醇各濃度組A值均低于陰性對(duì)照組(P<0.05)；各濃度組的早、晚期凋亡率與陰性對(duì)照組比較均增高(P<0.05)，除0.01 nmol/L組外，各組隨著濃度的增高其早、晚期的凋亡率也升高；低濃度(0.01 nmol/L)多烯紫杉醇處理的細(xì)胞阻斷G2/M期短暫、不完全，而高濃度(10 nmol/L)多烯紫杉醇對(duì)食管癌細(xì)胞的G2/M期阻斷較低濃度的完全、持久；多烯紫杉醇各濃度組處理的EC-109細(xì)胞Akt-1蛋白條帶灰度值與空白對(duì)照組比較顯著減弱，說明對(duì)其表達(dá)具有明顯抑制作用，其中10 nmol/L組最強(qiáng)，抑制率為85%，0.01 nmol/L較弱。結(jié)論多烯紫杉醇對(duì)人食管癌EC-109細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，使細(xì)胞分裂阻滯于G2/M期，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕多烯紫杉醇；食管癌；增殖；細(xì)胞周期

中圖分類號(hào)〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院

第一作者：趙艷平(1978-)，女，碩士，高級(jí)講師，主要從事藥理學(xué)研究。

食管癌是常見惡性腫瘤之一，早期轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)成為食管癌高死亡率的主要原因。食管癌是一種涉及癌基因過表達(dá)、抑癌基因缺失、突變的多基因異常疾病〔1〕。多烯紫杉醇(TxT)屬于植物堿類藥物，是一種新型抗癌藥物，對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物腫瘤具有明顯的抗腫瘤作用，其可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔2〕。目前多烯紫杉醇已作為化療藥物單獨(dú)或與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于臨床，主要治療乳腺癌、肺癌等，療效好，不良反應(yīng)較少〔3〕。多烯紫杉醇治療食管癌的相關(guān)報(bào)道較少。本研究觀察不同濃度多烯紫杉醇對(duì)體外培養(yǎng)食管癌EC-109細(xì)胞株增殖活性、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；噻唑藍(lán)(MTT)和碘化丙啶(PI)；熒光染料(Sigma公司，美國)；兔抗人Fas抗體、兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體和SP試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)，酶標(biāo)儀(ELX800uV型，Bio-Tek公司)，F(xiàn)ACSVantage SE型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2細(xì)胞株人食管癌EC-109細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所建系，本實(shí)驗(yàn)室凍存。接種細(xì)胞于含15%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng)瓶放置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.3MTT法測(cè)定多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長期的EC-109細(xì)胞和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔滴加200 μl單細(xì)胞懸液，使每孔含量1.4×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)接種6個(gè)96孔板，常規(guī)培養(yǎng)16 h后，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為0.01、0.10、1.00和10.00 nmol/L的多烯紫杉醇，空白對(duì)照組只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞作為比色時(shí)調(diào)零用。分別在常規(guī)培養(yǎng)20、40和60 h后取出2個(gè)培養(yǎng)板每孔滴加MTT溶液(5 g/L)20 μl，37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后終止培養(yǎng)。去除孔內(nèi)上清液，每孔滴加DMSO 200 μl,振蕩15 min。用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定各孔吸光度(A值)，記錄結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式，增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞凋亡的影響取對(duì)數(shù)生長期EC-109細(xì)胞，不同濃度(0.01、0.10、1.00和10.00 nmol/L)多烯紫杉醇作用48 h。每隔20 h取出不同藥物濃度細(xì)胞，收集細(xì)胞分別放入4個(gè)離心管內(nèi)標(biāo)記后進(jìn)行離心，制成細(xì)胞濃度為1×109個(gè)/L的單細(xì)胞懸液離心后棄上清液緩慢加入預(yù)冷70%無水乙醇7 ml，4℃過夜。采用PI單染法，以10%雞紅細(xì)胞作內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，與樣品同步染色，每份樣品中加入1 ml PI染液，在4℃避光孵育30 min。用488 nm氬離子激光器激發(fā)由630 nm帶通濾光片接收，通過散點(diǎn)圖收集10 000個(gè)細(xì)胞，分析PI熒光直方圖上凋亡細(xì)胞百分率。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期用4℃預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L；制備的細(xì)胞懸液用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液；陰性對(duì)照組加入500 μl PBS；其他藥物組分別加入100 μl RNase37℃水浴30 min；再加入400 μl PI染色混勻，4℃避光孵育30 min；上機(jī)檢測(cè)時(shí)細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾1次，記錄激發(fā)波長為488 nm處紅色熒光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western印跡檢測(cè)EC-109細(xì)胞蛋白激酶B(AKT-1)蛋白表達(dá)以1×106個(gè)/孔細(xì)胞密度接種EC-109細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度多烯紫杉醇作用48 h，同時(shí)設(shè)置未加藥物的陰性對(duì)照組，提取各組細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，經(jīng)PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，使用一抗，4℃孵育過夜，后加入二抗，4℃輕輕振搖2 h后洗二抗，顯影、定影、洗片。GAPDH作陰性對(duì)照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0行ANOVA方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同濃度多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞增殖的抑制作用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用各劑量組的平均A值表示細(xì)胞增殖情況及抑制率(表1)，多烯紫杉醇各個(gè)濃度組A值均低于空白對(duì)照組(P<0.05)；隨著藥物劑量的增加，細(xì)胞的存活率下降，增殖抑制作用增強(qiáng)，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表1　不同濃度多烯紫杉醇作用48 h對(duì)

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.2不同濃度多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞的凋亡影響各濃度組的早、晚期凋亡率與空白對(duì)照組比較均增高(P<0.05)，除0.01 nmol/L組外，各組隨著濃度的增高其早、晚期的凋亡率也升高(表2)。

表2　不同濃度多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞的

2.3不同濃度多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞周期的影響無論低濃度的多烯紫杉，還是高濃度的多烯紫杉醇均可將EC-109細(xì)胞阻滯于G2/M期。低濃度(0.01 nmol/L)多烯紫杉醇處理的細(xì)胞阻斷G2/M期短暫、不完全，而高濃度(10.00 nmol/L)多烯紫杉醇對(duì)食管癌細(xì)胞的G2/M期阻斷較低濃度的完全、持久，濃度愈高這種作用愈明顯(表3)。

表3　不同濃度多烯紫杉醇作用48 h后對(duì)

2.4不同濃度多烯紫杉醇對(duì)EC-109細(xì)胞Akt-1蛋白的影響0.01、0.10、1.00及10.00 nmol/L多烯紫杉醇組處理的EC-109細(xì)胞Akt-1蛋白條帶灰度值,分別為87.01±1.09、76.07±1.03、63.02±1.01及30.01±1.02，空白對(duì)照組比較顯著減弱〔(10.01±1.02)，P<0.05〕，說明對(duì)其表達(dá)具有明顯抑制作用，其中10.00 nmol/L組最強(qiáng)，抑制率為85%，0.01 nmol/L較弱。

3討論

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國食管癌的類型主要是鱗狀細(xì)胞癌，約占全部食管癌的90%〔4〕。已有〔5,6〕研究表明，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞的過度增殖、凋亡不足有關(guān)。凋亡細(xì)胞的DNA分子發(fā)生斷裂，分子量小的DNA片段穿過細(xì)胞膜丟失，分子量大的片段形成一個(gè)DNA含量小于二倍體的區(qū)域，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中形成位于G0/G1峰之前的G1峰，由于壞死的細(xì)胞檢測(cè)不出現(xiàn)此峰，故此峰被稱作凋亡峰，凋亡峰的高度和寬度與凋亡細(xì)胞的數(shù)量成正比〔7,8〕。

細(xì)胞凋亡是在免疫系統(tǒng)中保證在胸腺發(fā)育過程適當(dāng)去除自身免疫性T細(xì)胞和T細(xì)胞，以及下調(diào)對(duì)抗原的外周免疫應(yīng)答的一種動(dòng)態(tài)平衡〔9,10〕。因此T細(xì)胞凋亡是誘導(dǎo)中樞和外周耐受及預(yù)防自身免疫的重要過程。外周的自身免疫T細(xì)胞主要通過受體介導(dǎo)的活化誘導(dǎo)凋亡清除，而這一清除過程需要將細(xì)胞抗凋亡狀態(tài)轉(zhuǎn)變成促進(jìn)凋亡狀態(tài)，這一過程又被細(xì)胞因子、死亡受體及凋亡蛋白調(diào)控〔10,11〕。細(xì)胞凋亡主要通過受體介導(dǎo)的活化誘導(dǎo)凋亡通路和內(nèi)在的線粒體依賴通路激活，這兩種通路最后共同激活半胱氨酸酶瀑布樣反應(yīng)從而終止免疫反應(yīng)促使細(xì)胞凋亡〔12,13〕。本研究結(jié)果顯示，不同的濃度對(duì)細(xì)胞抑制增殖的程度大小有差異，同一時(shí)間藥物的劑量越大對(duì)細(xì)胞的抑制增殖作用越明顯，存在明顯的劑-效關(guān)系。多烯紫杉醇的濃度在0.01 nmol/L以上就可抑制EC-109食管癌細(xì)胞的生長，濃度大于10.00 nmol/L時(shí)幾乎完全抑制了EC-109食管癌細(xì)胞的集落形成。這提示多烯紫杉醇對(duì)EC-109食管癌細(xì)胞的抑制作用具有明顯的濃度依賴性。本研究顯示多烯紫杉醇能夠干擾細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有濃度差異，其中以10.00 nmol/L組效果最明顯，提示多烯紫杉醇對(duì)人食管癌EC-109細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，能使細(xì)胞分裂阻滯于G2/M期，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

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〔2014-05-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)