沉默LAIR-1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲功能的影響

沉默LAIR-1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲功能的影響

趙徽安雪青呂健東

(天津市第五中心醫(yī)院普外科，天津300450)

摘要〔〕目的探討白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體(LAIR)-1在乳腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法采用RT-PCR方法檢測乳腺癌細(xì)胞系和組織標(biāo)本中LAIR-1 mRNA的表達(dá)情況。采用電穿孔轉(zhuǎn)染法，將LAIR-1 siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，通過Western印跡檢測LAIR-1在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況。通過四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)增殖實(shí)驗(yàn)檢測LAIR-1對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響。通過傷Boyden小室檢測LAIR-1對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果同癌旁組織相比，乳腺癌組織中LAIR-1 mRNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；且同非轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織相比，轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中LAIR-1 mRNA的表達(dá)量亦顯著降低(P<0.01)。轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA可顯著抑制MCF-7細(xì)胞中LAIR-1的表達(dá)。抑制LAIR-1表達(dá)后，MCF-7細(xì)胞的增殖和侵襲能力均顯著升高(P<0.01)。結(jié)論LAIR-1具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用，乳腺癌組織中LAIR-1的低表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體-1；乳腺癌；增殖；侵襲

中圖分類號(hào)〔〕R739〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：呂健東(1967-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事甲狀腺、乳腺、胃腸道腫瘤研究。

第一作者：趙徽(1985-)， 女，碩士，主要從事專業(yè)乳腺外科研究。

乳腺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，然而乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚未完全研究清楚。白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體(LAIR)-1是一種具有免疫抑制功能的受體〔1〕。研究表明，LAIR-1分子在卵巢癌組織細(xì)胞和細(xì)胞系中存在不同水平的表達(dá)，且沉默卵巢癌細(xì)胞系(HO8910)細(xì)胞中LAIR-1分子表達(dá)可明顯增強(qiáng)HO8910細(xì)胞的增殖能力〔2〕。關(guān)于LAIR-1分子在乳腺癌組織中的表達(dá)情況及其與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文旨在探討LAIR-1分子在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為乳腺癌診斷尋找一個(gè)新的有效的腫瘤分子標(biāo)志物。

1材料與方法

1.1臨床資料選取2013 年10月11日至2014 年12月30日我院乳腺外科收治的乳腺癌患者60例，平均年齡(61.3±14.8)歲，其中轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者和非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者各30例。術(shù)前均未接受任何放化療和免疫治療。收取乳腺癌患者的癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本，離體后均立即凍存于液氮中，均經(jīng)過組織病理學(xué)診斷證實(shí)為乳腺癌。

1.2細(xì)胞及主要試劑人乳腺癌細(xì)胞系(MD231)及MCF7細(xì)胞均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，Lonza轉(zhuǎn)染試劑購自Lonza公司； TRIzol購自美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒購自Ambion公司；侵襲實(shí)驗(yàn)用Boyden小室購自美國Millipore公司。

1.3RT-PCR 取出液氮中保存的組織，研碎，采用Trizol提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct方法計(jì)數(shù)LAIR-1的相對(duì)表達(dá)量。LAIR-1上游引物：5'-CCGTCGGACAACAGTCACAA-3'；下游引物：5'-CGTCGGACAACAGTCACAATTT-3'。細(xì)胞長至70%融合時(shí)可用于轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照Lonza轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染36 h后可用于功能實(shí)驗(yàn)〔3〕。采用Western印跡方法檢測MCF-7細(xì)胞中LAIR-1的表達(dá)情況〔4〕，四甲偶氮唑藍(lán)比色(MTT)方法檢測LAIR-1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響〔5〕。采用Boyden小室分析檢測細(xì)胞侵襲能力〔5〕。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1LAIR-1在乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)乳腺癌癌旁組織中，LAIR-1的相對(duì)表達(dá)量為1.38±0.15，乳腺癌組織中為0.54±0.05，二者相比差異顯著(P<0.01)。非轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的LAIR-1的相對(duì)表達(dá)量為0.64±0.11，轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中為0.33±0.02，二者相比差異顯著(P<0.01)。低侵襲能力的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中LAIR-1的相對(duì)表達(dá)量為0.93±0.22，高侵襲能力的乳腺癌細(xì)胞系MD231中為0.69±0.16，二者相比差異顯著(P<0.01)。

2.2轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中LAIR-1表達(dá)檢測轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中LAIR-1的表達(dá)被顯著抑制。見圖1。

圖1　轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中LAIR-1表達(dá)檢測

2.3siRNA干擾抑制LAIR-1增加乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力乳腺癌MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染第3天時(shí)，增殖能力在模擬組、對(duì)照組和轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA組分別為(0.67±0.11)、(0.69±0.09)和(1.14±0.14)；第5天時(shí)，分別為(1.17±0.21)、(1.19±0.18)和(2.07±0.41)；第7天時(shí)，分別為(1.86±0.23)、(1.91±0.25)和(2.56±0.26)。轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖能力顯著升高(P<0.01)。

2.4siRNA干擾抑制LAIR-1增加乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)分別為(46.24±13.54)、(45.36±15.63)和(106.13±25.46)。轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力顯著升高(P<0.01)。見圖2。

圖2　LAIR-1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

3討論

腫瘤是世界人口死亡的第2大原因，近30年來世界范圍內(nèi)腫瘤致死率增加近2倍〔6〕。腫瘤種類約有200多種，其中乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌總發(fā)病率約占所有癌癥發(fā)生率的一半以上〔7〕。乳腺癌是腫瘤最常見的一種類型，占腫瘤發(fā)病率的27%，致死率占腫瘤致死率的16%。已知乳腺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因。然而，乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚未完全研究清楚。

LAIR-1是一種具有免疫抑制功能的受體，含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)〔2～4〕。LAIR-1主要表達(dá)于髓系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中，包括自然殺傷(NK)細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核細(xì)胞來源樹突細(xì)胞(DC)和造血祖細(xì)胞〔8～10〕。結(jié)合以往研究結(jié)果證實(shí)高表達(dá)于免疫細(xì)胞的多種抑制性受體家族成員，

如程序死亡受體-1(PD-1)和NK細(xì)胞抑制性受體(NKG2A)均與腫瘤免疫逃逸相關(guān)。國內(nèi)已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞也表達(dá)LAIR-1〔11〕，推測LAIR-1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究表明，LAIR-1分子在卵巢癌組織細(xì)胞和細(xì)胞系中存在不同水平的表達(dá)，且沉默卵巢癌細(xì)胞系(HO8910)細(xì)胞中LAIR-1分子表達(dá)可明顯增強(qiáng)HO8910細(xì)胞的增殖能力。雖然已證實(shí)LAIR-1在卵巢癌中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于LAIR-1表達(dá)于乳腺癌腫瘤細(xì)胞的報(bào)道還沒有，且其作用機(jī)制尚未完全明確。

本研究結(jié)果初步提示LAIR-1分子與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。另外，當(dāng)敲低乳腺癌MCF-7細(xì)胞中LAIR-1分子的表達(dá)后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和侵襲能力均顯著升高。

綜上，LAIR-1分子可通過影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力進(jìn)而發(fā)揮乳腺癌抑制作用。乳腺癌中LAIR-1分子表達(dá)的顯著降低與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-03-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)