破骨樣細(xì)胞中骨保護(hù)素和NF-κB配體受體的表達(dá)及其意義

破骨樣細(xì)胞中骨保護(hù)素和 NF-κB配體受體的表達(dá)及其意義

聶斌管思明1張韶英方欣1周韶瓊1

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院老年病科，湖北武漢430014)

摘要〔〕目的探討破骨樣細(xì)胞中骨保護(hù)素(OPG)和 NF-κB配體受體(RANKL)表達(dá)情況。方法單獨(dú)培養(yǎng)骨髓單核細(xì)胞前體，用巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和維生素D誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為破骨樣細(xì)胞，在0、5、10、15 d用光鏡觀察和TRAP染色(抗酒石酸染色)評(píng)估破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度，用RT-PCR檢測(cè)OPG和RANKL的表達(dá)情況；然后構(gòu)建主動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞(SMC)與骨髓單核細(xì)胞前體共培養(yǎng)的模型，用維生素C和β-磷酸甘油誘導(dǎo)SMC轉(zhuǎn)化為成骨樣細(xì)胞，并在0、5、10、15 d用同樣方法再次檢測(cè)共培養(yǎng)中破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的情況，以及兩種細(xì)胞中OPG和RANKL的表達(dá)情況。結(jié)果不管是單獨(dú)培養(yǎng)、還是共培養(yǎng)，破骨樣細(xì)胞中始終沒(méi)有OPG和RANKL的表達(dá)。結(jié)論破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可能主要受成骨樣細(xì)胞分泌的OPG和RANKL調(diào)控，本身并沒(méi)有分泌OPG和RANKL進(jìn)行自身調(diào)節(jié)的機(jī)制存在。

關(guān)鍵詞〔〕骨保護(hù)素；NF-κB配體受體；成骨樣細(xì)胞；破骨樣細(xì)胞

中圖分類號(hào)〔〕R68〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：武漢市衛(wèi)生計(jì)生委科研基金資助(No.WX15C42)

通訊作者：管思明(1951-)，女，主任醫(yī)師，主要從事老年心血管病專業(yè)研究。

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢協(xié)和醫(yī)院老年病科

張韶英(1963-)，女，主任醫(yī)師，主要從事老年心血管病專業(yè)研究。

第一作者：聶斌(1976-)，男，主治醫(yī)師，主要從事老年心血管病專業(yè)研究。

近年來(lái)研究表明，動(dòng)脈鈣化是與骨形成相似的一種高度可調(diào)控的過(guò)程〔1〕。動(dòng)脈中存在著類似于骨中成骨細(xì)胞活性的成骨樣細(xì)胞，導(dǎo)致動(dòng)脈局部的鈣沉積；同時(shí)也存在著類似骨中破骨細(xì)胞活性的破骨樣細(xì)胞，可吸收動(dòng)脈局部的鈣化。如果成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化增多，而破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化不足，則會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈鈣化的形成〔2〕。目前的研究表明，破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化主要受骨保護(hù)素(OPG)/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB配體受體(RANKL)(OPG/RANKL)系統(tǒng)的調(diào)控〔3〕。但對(duì)于破骨樣細(xì)胞自身是否能分泌OPG、RANKL進(jìn)行自我調(diào)控，卻一直很少有研究報(bào)道。本文擬探討破骨樣細(xì)胞是否存在分泌OPG/RANKL進(jìn)行自我調(diào)控的機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料健康雄性SD大鼠，體重180～200 g,購(gòu)自同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；大鼠骨鈣素抗體，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒，鈣檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bioss公司；大鼠OPG抗體、RANKL抗體購(gòu)自R等D Systems公司；維生素D、維生素C、β-磷酸甘油、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)購(gòu)自上海信宜藥業(yè)公司； OPG和RANKL的引物由ProMab公司合成。

1.2破骨樣細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)

1.2.1單核細(xì)胞前體的取材、培養(yǎng)〔4〕選用6周齡雄性SD大鼠，斷頸處死，無(wú)菌條件下分離股骨，暴露髓腔后用α-MEM培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)沖洗骨髓腔，沖洗液用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，收集接種于25 ml培養(yǎng)瓶，在5%CO2，37℃培養(yǎng)24 h后，收集未貼壁的細(xì)胞，加入淋巴分離液，進(jìn)行Ficoll/Hypaque梯度離心，然后收集表面的單核細(xì)胞層,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，接種于含有α-MEM培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)的六孔板中，并在培養(yǎng)液中加入100 U/ml 的青霉素,和100 μg/ml的鏈霉素。

1.2.2誘導(dǎo)單核細(xì)胞前體向破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化在上述培養(yǎng)液中加入25 ng/ml的M-CSF和1×10-8mol/L的維生素D，分別在第0、5、10、15天，用以下方法檢測(cè)單核細(xì)胞前體向破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況。(1)破骨樣細(xì)胞鏡下形態(tài)學(xué)觀察。(2)破骨樣細(xì)胞的抗酒石酸(TRAP)染色檢測(cè)：常規(guī)細(xì)胞爬片，去離子水洗3次，浸入新配置的TRAP染色孵育液37℃中1 h，然后去離子水洗3次，中性樹(shù)膠封片，最后在光鏡下觀察，陽(yáng)性為顯示暗紅色。(3)破骨樣細(xì)胞的OPG和RANKL表達(dá)：引物由primer3.0軟件設(shè)計(jì),并由ProMab公司合成。OPG(rattus)-正義：5'-ATCGGCCACGCGAACCTCAC-3'，OPG(rattus)-反義：5'-GCTGCTCGCTGGGTTTGCAG-3'，片段長(zhǎng)度155 bp，退火溫度59℃；RANKL(rattus)-正義：5'-AGCCTTTCAAGGGGCCGTGC-3'，RANKL(rattus)-反義：5'-GGGCCACATCGAGCCACGAA-3'，片段長(zhǎng)度104 bp，退火溫度58℃。

1.3共培養(yǎng)

1.3.1成骨樣細(xì)胞和破骨樣細(xì)胞共培養(yǎng)模型的構(gòu)建〔5〕選取6周齡雄性SD大鼠，無(wú)菌條件下分離主動(dòng)脈，去除筋膜，沿縱軸剪開(kāi)動(dòng)脈，小心刮去內(nèi)膜，然后剝下中膜，剪成約1 mm×1 mm的小組織塊，放入裝有DMEM(含20%胎牛血清)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，并加入100 U/ml 的青霉素和100 μg/ml 的鏈霉素。待細(xì)胞從組織塊中游出后，收集放入5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。SMC的鑒定采用光鏡下形態(tài)學(xué)觀察和SMC的特異性標(biāo)志物α-actin的免疫熒光染色法。實(shí)驗(yàn)所用SMC為培養(yǎng)的第6～8代細(xì)胞；SMC和單核細(xì)胞前體的共培養(yǎng)則如文獻(xiàn)〔6〕所述，首先將SMC種植于非接觸性共培養(yǎng)體系的下層Lab-TeK腔室玻片上,然后將單核細(xì)胞前體種植于上層tissue culture insert(NUNC產(chǎn)品)中。共培養(yǎng)細(xì)胞體系也隨機(jī)分為兩組：正常組和鈣化組，正常組即為SMC和單核細(xì)胞前體的普通共培養(yǎng)，鈣化組則在此培養(yǎng)液中再加入10 mmol/L β-磷酸甘油和50 μg/ml維生素C，以誘導(dǎo)其中的SMC形成鈣化。并在第0,5，10,15天收集兩種細(xì)胞分別進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.3.2共培養(yǎng)中成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度的檢測(cè)

1.3.2.1成骨樣細(xì)胞中鈣離子含量的測(cè)定收集共培養(yǎng)中的成骨樣細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞用PBS洗三次后，加入0.6 mol/L的HCl，37℃孵育24 h脫鈣，收集脫鈣上清液，用鈣測(cè)定試劑盒(鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法)檢測(cè)細(xì)胞的鈣離子含量；另外，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞的蛋白含量，最后結(jié)果用蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞鈣含量(以μg/mg protein表示)。

1.3.2.2成骨樣細(xì)胞中ALP活性的檢測(cè) 收集共培養(yǎng)中成骨樣細(xì)胞，首先用超聲波裂解細(xì)胞，然后向微孔板內(nèi)添加100 μl底物緩沖液和20 μl樣品，在微孔板振蕩器上充分振蕩1 min后，37℃孵育15 min。添加80 μl反應(yīng)終止液，在微孔板振蕩器上充分振蕩1 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)量405 nm處的吸光值，計(jì)算出ALP活性值，最后結(jié)果再用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定的蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.2.3成骨樣細(xì)胞中骨鈣素的Western印跡檢測(cè)收集共培養(yǎng)中成骨樣細(xì)胞，常規(guī)勻漿，提蛋白，蛋白質(zhì)變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，使用三明治電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后置于5%的脫脂奶粉中封閉，4℃過(guò)夜。棄去封閉液，用PBST漂洗2～3次，加入按1∶100稀釋后的一抗抗大鼠骨鈣素單克隆抗體，室溫下于搖床孵育2 h，PBST漂洗后加入末辛根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫下于搖床孵育1 h，PBST漂洗后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，最后以Gel pro4.0 版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行測(cè)量分析。

1.3.3共培養(yǎng)中破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度的檢測(cè)收集共培養(yǎng)中破骨樣細(xì)胞，使用上述1.2.2中方法，檢測(cè)破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度。

1.3.4共培養(yǎng)中兩組細(xì)胞的OPG和RANKL實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)收集共培養(yǎng)中的成骨樣細(xì)胞和破骨樣細(xì)胞，分別進(jìn)行OPG和RANKL的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)方法如前所述。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1破骨樣細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)

2.1.1單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況 單核細(xì)胞前體經(jīng)過(guò)15 d誘導(dǎo)后，大多數(shù)轉(zhuǎn)化為多核巨細(xì)胞，有偽足，并可以借助偽足的凹凸伸縮而變化形態(tài)，而且TRAP染色顯示為紅色。表明培養(yǎng)的單核細(xì)胞前體經(jīng)誘導(dǎo)后大多數(shù)已轉(zhuǎn)化為破骨樣細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1　破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

2.1.2單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)破骨樣細(xì)胞中OPG、RANKL的表達(dá)情況在單核細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化為破骨樣細(xì)胞的過(guò)程中，無(wú)論在第0、5、10、15天，其OPG、RANKL的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)均表現(xiàn)為無(wú)或極其微弱。

2.2共培養(yǎng)

2.2.1共培養(yǎng)時(shí)成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況共培養(yǎng)中，SMC經(jīng)鈣化誘導(dǎo)15 d后，其鈣離子含量、ALP活性、骨鈣素Western印跡檢測(cè)都為強(qiáng)陽(yáng)性，表明經(jīng)過(guò)鈣化誘導(dǎo)，SMC已成功轉(zhuǎn)化為成骨樣細(xì)胞。見(jiàn)表1。

表1　成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化對(duì)比 ± s)

與0 d比較：1)P<0.05

2.2.2共培養(yǎng)時(shí)破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況共培養(yǎng)15 d后，單核細(xì)胞前體中僅有一小部分轉(zhuǎn)化為多核巨細(xì)胞，有偽足，并可以借助偽足的凹凸伸縮而變化形態(tài)，且TRAP染色顯示為紅色。以上結(jié)果表明共培養(yǎng)15 d后，單核細(xì)胞前體中有一小部分轉(zhuǎn)化為破骨樣細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

圖2　破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況

2.2.3共培養(yǎng)時(shí)成骨樣細(xì)胞OPG、RANKL的表達(dá)情況共培養(yǎng)中，成骨樣細(xì)胞無(wú)論在第0、5、10、15天均一直有OPG表達(dá)，且在第0、5、10天中，OPG的表達(dá)一直呈上升趨勢(shì)，而在第15天OPG的表達(dá)明顯下降。成骨樣細(xì)胞在第0天無(wú)RANKL表達(dá)， 而第5、10、15天均有RANKL表達(dá)，且表達(dá)也一直呈上升趨勢(shì)(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　成骨細(xì)胞OPG、RAWKL表達(dá)情況

2.2.4共培養(yǎng)時(shí)破骨樣細(xì)胞OPG、RANKL的表達(dá)情況共培養(yǎng)中，破骨樣細(xì)胞無(wú)論在第0、5、10、15天，OPG、RANKL的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)均仍為無(wú)或極其微弱。

3討論

動(dòng)脈鈣化是鈣磷在動(dòng)脈壁沉積的一種病理性表現(xiàn)，與各種心血管事件發(fā)生率的增加直接相關(guān)。近年來(lái)許多研究證實(shí)，動(dòng)脈鈣化的形成并非只是鈣磷的被動(dòng)沉積，而是與骨形成類似的一種高度可調(diào)控的主動(dòng)過(guò)程。其中破骨樣細(xì)胞因具有抑制動(dòng)脈局部鈣化發(fā)展的作用，從而在動(dòng)脈鈣化的防治方面具有很好的前景，闡明破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化調(diào)控的機(jī)制因此也具有重要意義〔7〕。目前認(rèn)為影響破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化最關(guān)鍵的是OPG/RANKL系統(tǒng)，RANKL促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化而OPG則相反。動(dòng)脈壁的一些細(xì)胞，主要是SMC，在發(fā)生鈣化轉(zhuǎn)化為成骨樣細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)分泌出大量的OPG和RANKL，進(jìn)而調(diào)控局部的破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化〔8〕。

本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了破骨樣細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)化的模型，發(fā)現(xiàn)此過(guò)程中并沒(méi)有明顯的OPG和RANKL的表達(dá)。雖然單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)破骨樣細(xì)胞并沒(méi)有表達(dá)OPG和RANKL，但并不一定就意味著破骨樣細(xì)胞本身沒(méi)有分泌OPG和RANKL進(jìn)行自身轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)的可能。因?yàn)樵谌梭w中很可能存在著各種細(xì)胞之間相互作用的復(fù)雜機(jī)制。在動(dòng)脈鈣化發(fā)生的過(guò)程中，也許當(dāng)成骨樣細(xì)胞和破骨樣細(xì)胞兩者共存時(shí)，成骨樣細(xì)胞分泌出的某些因子會(huì)影響破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使得后者可以分泌OPG、RANKL，參與自身轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)。這正如在骨代謝中，單獨(dú)培養(yǎng)破骨細(xì)胞時(shí)，即使加入足夠的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑，但是能轉(zhuǎn)化成熟的破骨細(xì)胞也往往較少；而當(dāng)把成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞放在一起共同培養(yǎng)時(shí)，因兩者之間發(fā)生的復(fù)雜相互作用，最后就可以誘導(dǎo)出大量的成熟破骨細(xì)胞〔9〕。因此，本文又構(gòu)建了成骨樣細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞兩者共培養(yǎng)的模型以模擬人體動(dòng)脈的微環(huán)境，并在培養(yǎng)液中加入了鈣化誘導(dǎo)劑以誘導(dǎo)SMC轉(zhuǎn)化為成骨樣細(xì)胞，以模擬動(dòng)脈發(fā)生鈣化的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)表明，破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)可能主要受成骨樣細(xì)胞分泌的OPG、RANKL影響，本身并沒(méi)有進(jìn)行自我調(diào)節(jié)的機(jī)制存在。

另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)：在兩者共培養(yǎng)的模型中，當(dāng)SMC發(fā)生鈣化轉(zhuǎn)化為成骨樣細(xì)胞時(shí)，只有一小部分的單核細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化為破骨樣細(xì)胞。這也和許多學(xué)者在臨床實(shí)踐和動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致：即在發(fā)生鈣化的動(dòng)脈壁上，往往可以檢測(cè)到大量的鈣化細(xì)胞(即成骨樣細(xì)胞)，卻只有很少量的破骨樣細(xì)胞存在〔10〕。分析造成這種現(xiàn)象的原因很可能是在正常狀態(tài)，鈣化的早期以及中期，成骨樣細(xì)胞中都有大量的OPG表達(dá)，卻沒(méi)有或僅有少量的RANKL表達(dá)，RANKL的含量相對(duì)于OPG處于明顯劣勢(shì)，致使此時(shí)RANKL促破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能完全被OPG所抑制，局部的單核細(xì)胞前體得不到RANKL的誘導(dǎo)，因此不能轉(zhuǎn)化為破骨樣細(xì)胞；只有到了鈣化晚期，此時(shí)成骨樣細(xì)胞OPG的表達(dá)已經(jīng)明顯下降，而RANKL的表達(dá)則比以前明顯升高，因此RANKL促破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能開(kāi)始可以有所發(fā)揮。單核細(xì)胞前體有了RANKL的誘導(dǎo)，于是出現(xiàn)少量的破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本文認(rèn)為，之所以無(wú)論在細(xì)胞共培養(yǎng)的模型還是宏觀動(dòng)物模型中都只發(fā)現(xiàn)少量的破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是因?yàn)榇蠖鄶?shù)情況下局部微環(huán)境中OPG的含量超過(guò)了RANKL的含量,使得RANKL促破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能無(wú)法發(fā)揮出來(lái)所致。

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〔2015-02-15修回〕

(編輯袁左鳴)