GRIM-19蛋白在taurolidine誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡中的作用

GRIM-19蛋白在taurolidine誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡中的作用

孫寶勝孟凡旭于士龍郎志國孫世龍1劉林林2劉士新

(吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長春130000)

摘要〔〕目的探討GRIM-19蛋白在taurolidine誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細胞凋亡中的作用。方法應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測不同劑量組宮頸癌細胞(Hela細胞系)存活率的影響；采用流式細胞術(shù)檢測不同劑量組Hela細胞的凋亡數(shù)據(jù)；采用Western印跡法檢測各實驗組中Hela細胞中GRIM-19蛋白的表達變化；同時采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測半胱氨酸蛋白酶(caspase)9的活性。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，taurolidine對Hela細胞生長有顯著的抑制作用，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示出實驗組Hela細胞凋亡比例顯著上升，并呈現(xiàn)出明顯的時程和量效關(guān)系(P<0.05)。Western印跡分析顯示，與對照組相比，GRIM-19蛋白在各實驗組Hela細胞中的表達顯著提高(P<0.05)，同樣顯示出了一定的時程和量效關(guān)系。ELISA檢測結(jié)果顯示，caspase-9在各實驗組Hela細胞中的表達顯著增加，與GRIM-19蛋白的表達顯示出了相當?shù)囊恢滦?。結(jié)論Taurolidine可通過促進GRIM-19蛋白的表達誘導(dǎo)Hela細胞的凋亡，且線粒體凋亡很可能是taurolidine誘導(dǎo)Hela細胞凋亡的重要途徑。

關(guān)鍵詞〔〕宮頸腫瘤；基因表達；細胞凋亡；Taurolidine；GRIM-19

中圖分類號〔〕R730.53〔

基金項目：吉林省發(fā)改委資助項目(No.2013C033)

通訊作者：劉士新(1964-)，男，教授，主要從事腫瘤放射治療研究。

1吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院2吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院

第一作者：孫寶勝(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤放射治療研究。

最近研究發(fā)現(xiàn)，taurolidine具有明顯的抑制腫瘤細胞生長和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用〔1～4〕。然而，taurolidine在不同的腫瘤細胞中，誘導(dǎo)凋亡的分子生物學(xué)機制不同。有研究報道，taurolidine通過提高線粒體中細胞色素c等凋亡因子的表達，激活半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)和caspase-3，誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡〔5〕；也有文獻報道，taurolidine通過激活線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡的同時，還通過激活Fas-liand，啟動死亡受體途徑，誘導(dǎo)腦神經(jīng)膠質(zhì)癌細胞凋亡〔2〕。GRIMs是Kalvakolanu等發(fā)現(xiàn)的一群參與干擾素(IFN)/維甲酸(RA)聯(lián)合誘導(dǎo)細胞凋亡的基因。Seo等〔6〕發(fā)現(xiàn)，GRIM-19與病毒感染密切相關(guān)，指出乳頭瘤病毒(HPV)-E6可與GRIM-19直接結(jié)合，誘導(dǎo)對宮頸癌及其癌前病變的發(fā)生。本研究旨在觀察taurolidine對人宮頸癌Hela細胞是否具有誘導(dǎo)凋亡的特性，以及誘導(dǎo)凋亡的分子生物學(xué)機制。

1材料與方法

1.1試劑細胞培養(yǎng)液、小牛血清、青鏈霉素、谷氨酰胺、胰酶和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購買于Invitrogen公司(Paisley，Scotland，UK)。taurolidine(Taurolin)溶劑由Geistlich Pharm AG(Wolhusen，Switzerland)贈送。除了在文章中具體指出，所有其他的化學(xué)試劑均購買于Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)。

1.2細胞及培養(yǎng)人宮頸癌Hela細胞購買于美國細胞庫(Manassas，VA)。Hela細胞均在含有10%小牛血清、青霉素(100 U/ml)和谷氨酰胺(2 mmol/L)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在37℃、5% CO2孵箱中貼壁生長。

1.3細胞存活實驗待Hela細胞生長為指數(shù)期，調(diào)細胞濃度為1×105/ml。將Hela細胞種植在96孔培養(yǎng)板(100 μl/well)中，24 h后，分別給予不同濃度的taurolidine(0，10，25，50，100，200 μmol/L)。腫瘤細胞在37℃，CO2孵箱中培養(yǎng)24 h和48 h后，給予100 μl噻唑藍(MTT，5.0 mg/ml)。3 h后，吸去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min在酶聯(lián)免疫吸附儀上測量各孔光吸收值(CPM)。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組CPM值/對照組CPM值)×100%。

1.4細胞凋亡的檢測待Hela細胞接近對數(shù)生長期，常規(guī)消化細胞，制成2.5×105細胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中。24 h 后，分別給予不同濃度的taurolidine，并確定最終藥物濃度分別為0，10，25，50，100，200 μmol/L。Hela細胞在37℃，CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，將貼壁及懸浮的細胞離心，收集后震蕩、混勻在碘化丙啶(PI)混合溶液中(50 μg/ml propidium iodide、3.4 mmol/L sodium citrate、1.0 mmol/L Tris、0.1 mmol/L EDTA、0.1% Triton X-100)，并在4℃環(huán)境中避光培養(yǎng)4～6 h。流式細胞儀(BD biosciences，Mountain View，CA)進行檢測，Cell Guest軟件(BD Biosciences)收集并分析結(jié)果。

1.5GRIM-19蛋白表達變化的檢測待Hela細胞生長為指數(shù)期，將5×106細胞懸液種植在25 cm2培養(yǎng)瓶中貼壁、過夜后，用含有taurolidine的培養(yǎng)液調(diào)為理想的藥物濃度和作用時間。用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗上述細胞3次，棄去洗液并吸凈殘余的PBS液體。在培養(yǎng)皿中加入200 μl細胞裂解液混勻、冰浴30 min。15 000 r/min離心10 min后，通過Lowry method進行總蛋白定量分析。將樣品上清液分裝，-20℃保存。制備12%分離膠、5%積層膠。按計算好的樣品量上樣，使各組上樣量相等，在8 V/era電壓條件下開始進行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，待溴酚藍進入分離膠時，將電壓提高到15 V/era，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達凝膠底部。電泳結(jié)束后，將SDS聚丙烯酰胺分離出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Millipore，Bedford，MA，USA)。用含有5 %脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TrBS)(150 mmol/L NaCl、Tris、0.1% Tween20，pH 7.5)對上述硝酸纖維素濾膜進行封閉2 h，一抗GRIM-19(cell signal)室溫孵育2 h，相應(yīng)的二抗室溫孵育1.5 h，增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒顯色(Perkin Elmer)，拍照。

1.6caspase-9活性的檢測caspase-9的活性由ApoTarget 試劑盒(BioSource International Inc，CA)檢測。Hela細胞(5×106)接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中貼壁；過夜后，給予含有taurolidine的培養(yǎng)液，并調(diào)定taurolidine藥物終濃度為0、25、50和100 μmol/L。37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，提取細胞總蛋白，并進行定量分析。將100 μg蛋白同200 μmol/L底物混勻，在37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)3 h之后通過酶標儀檢測其吸光度值A(chǔ)值，490 nm。

2結(jié)果

2.1Taurolidine對Hela細胞存活率的影響當50 μmol/L的taurolidine作用于Hela細胞48 h時，導(dǎo)致了58%的細胞壞死，并顯示明顯的時效和量效關(guān)系。見表1。

2.2Taurolidine對Hela細胞凋亡的影響對照組的Hela細胞在培養(yǎng)48 h后，僅僅產(chǎn)生了<5%的細胞凋亡，當50 μmol/L的taurolidine作用于Hela細胞48 h后，可導(dǎo)致8.97 %的細胞凋亡，100 μmol/L的taurolidine作用于Hela細胞48 h后，可導(dǎo)致22.37 %的細胞凋亡，顯示了明顯的時效和量效的關(guān)系。見表2。

表1　不同濃度taurolidine作用于Hela細胞24 h和

表2　不同濃度taurolidine作用于Hela細胞24 h和48 h

2.3Western印跡法檢測GRIM-19蛋白的表達變化由于taurolidine(50 μmol/L)在24 h能夠顯著的誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，所以選擇50 μmol/L的taurolidine作用于Hela細胞0、3、6、12和24 h后，觀察其對GRIM-19蛋白的影響，結(jié)果顯示：taurolidine能明顯促進GRIM-19蛋白的表達，并具有明顯的時效關(guān)系。見圖1。

圖1　Taurolidine作用于Hela細胞在不同時間點對 GRIM-19表達的影響

2.4caspase-9活性的測定0、25、50和100 μmol/L的taurolidine作用于Hela細胞24 h后，caspase-9活性(A490 nm)分別為0.05、0.15、0.30和0.50，結(jié)果顯示了明顯的劑量依賴效應(yīng)。

3討論

近幾年許多文獻報道，taurolidine可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡，并且在體內(nèi)動物實驗中證實其抑制腫瘤局部生長及遠距離轉(zhuǎn)移作用〔1，3，4〕。本實驗結(jié)果顯示，taurolidine具有明顯的誘導(dǎo)Hela細胞凋亡以及抑制細胞生長的特性，并且顯示了明顯的時間與量效依賴關(guān)系。

高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因，有研究發(fā)現(xiàn)，GRIM-19與病毒感染密切相關(guān)，指出HPV-E6可與GRIM-19直接結(jié)合，且高危型HPV的結(jié)合作用強于低危型，GRIM-19可能對宮頸癌的治療和預(yù)后有提示作用〔6〕。Chidambaram等〔7〕研究表明，GRIM-19基因在人體多種正常組織中可被檢測，參與IFN/RA誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡。周穎等〔8〕采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將GRIM-19重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到宮頸癌Hela細胞，發(fā)現(xiàn)GRIM-19基因在宮頸癌Hela/GRIM-19細胞中表達顯著升高，抑制細胞增殖，使腫瘤生長速度減慢，在一定程度上控制腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為〔8〕。

綜上所述，本實驗結(jié)果為taurolidine誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的信號傳導(dǎo)提供理論依據(jù)，并且為在體內(nèi)觀察該化學(xué)藥物的抗腫瘤作用提供理論支持。

4參考文獻

1McCourt M，Wang JH，Sookhai S.Taurolidine inhibits tumor cell growth in vitro and in vivo〔J〕.Ann Surg Oncol，2000；7(9)：685-791.

2Stendel R，Scheurer L，Stoltenburg-Didinger G，etal.Enhancement of Fas-ligand-mediated programmed cell death by taurolidine〔J〕.Anticanser Res，2003；23(3B)：2309-14.

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6Seo T，Lee D，Shim YS，etal.Viral interferon regulatory factor 1 of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus interacts with a cell death regulator，GRIM-19，and inhibits interferon/retinoic acid-induced cell death〔J〕.J Virol，2002；76(17)：8797-807.

7Chidambaram NV，Angelle JE，Ling W，etal.Chromosomal localization of human GRIM-19，a novel IFN-β and retinoic acid-activated regulator of cell death〔J〕.J Interferon Cytokine Res，2000；20(7)：661-5.

8周穎，衛(wèi)瑩，李敏，等.GRIM-19表達對子宮頸癌Hela細胞增殖的影響〔J〕.腫瘤，2009；29(10)：940-3.

〔2013-06-17修回〕

(編輯袁左鳴)