潰瘍性結腸炎大鼠血清白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-4動態(tài)表達規(guī)律

潰瘍性結腸炎大鼠血清白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-4動態(tài)表達規(guī)律

朱向東曹燕飛王燕汪斌段永強

(甘肅中醫(yī)學院，甘肅蘭州730000)

摘要〔〕目的探討潰瘍性結腸炎(UC)大鼠血清白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-4的動態(tài)表達規(guī)律。方法將60只大鼠隨機分為空白組10只、乙醇組10只，模型組40只(3、7、14、21 d各10只)，采用TNBS/乙醇灌腸法制備潰瘍性結腸炎大鼠模型，于制模后3、7、14、21 d 4個時間點采用ELISA法檢測大鼠血清IL-1β、 TNF-α、IL-4水平，光鏡觀察結腸組織形態(tài)并評分。結果制模后3 d大鼠結腸出現(xiàn)炎癥和潰瘍，且隨著時間推移而加重，7～14 d潰瘍和炎癥最為嚴重，21 d潰瘍和炎癥已經(jīng)有所修復。模型組各時間點大鼠血清促炎因子IL-1β、TNF-α均高于空白組和乙醇組，抗炎因子IL-4水平均低于空白組和乙醇組，以7 d和14 d升高或降低更為顯著(P<0.05、P<0.01)； 7、14 d組與3d組比較，IL-1β、 TNF-α水平進一步升高(P<0.01)，而IL-4水平進一步降低(P<0.01)；21 d組與7、14 d組比較，IL-1β、 TNF-α水平下降，而IL-4水平則升高(P<0.05)。結論促炎因子IL-1β、 TNF-α和抗炎因子IL-4在UC發(fā)病中起重要作用，UC的發(fā)病及嚴重程度與促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-4的動態(tài)表達及失衡密切相關。

關鍵詞〔〕潰瘍性結腸炎(UC)；白細胞介素-1β；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-4

中圖分類號〔〕R574.62〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81060283)

通訊作者：王燕(1979-)，女，碩士，講師，主要從事中醫(yī)藥防治潰瘍性結腸炎的應用基礎研究。

第一作者：朱向東(1973-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事中醫(yī)藥防治潰瘍性結腸炎的應用基礎研究。

潰瘍性結腸炎(UC)是以腹痛腹瀉、 黏液膿血便持續(xù)或反復發(fā)作為主要癥狀，具有癌變傾向，屬于難治性消化系統(tǒng)疾病，目前尚缺乏滿意的治療方法。該病發(fā)病原因及機制尚不明確。目前促炎細胞因子及抑炎細胞因子失衡機制越來越受到人們的重視〔1〕。體外研究表明促炎性細胞因子白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和抗炎細胞因子IL-4等可以通過多種病理學作用參與腸黏膜炎性反應的發(fā)生和發(fā)展過程〔2〕。本研究通過動態(tài)測定UC模型大鼠血清炎性反應細胞因子水平，探討其在UC發(fā)病機制中的作用。

1資料與方法

1.1動物采用SPF級Wistar大鼠30只，體質量160～200 g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學院科研實驗動物中心提供，SPF級動物質量合格證號：SCXKC(甘)2004-0006；SPF級實驗設施合格證號：SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.2試劑蛋白標準液、考馬斯亮藍溶液(20090825)均購自南京建成生物工程公司；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：購于北京邦定泰克生物技術有限公司，由美國Sigma公司生產，批號為(2008-16-2)；大鼠IL-β、TNF-α、IL-4檢測試劑盒購自深圳市達科為生物技術有限公司。

1.3儀器與設備Biorad iMark酶標儀(美國BLO-RAD公司)；CT14RD高速冷凍離心機(天美科技有限公司)；303-2型恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永鑫實驗設備儀器公司) 。

1.4方法

1.4.1造模方法采用TNBS/乙醇溶液灌腸法制作UC大鼠模型：將大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性將TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡膠輸液管輕緩注入大鼠距肛門約7～8 cm深的腸腔內，留置數(shù)分鐘，讓動物保持平躺狀態(tài)，自然清醒。

1.4.2分組與給藥、取材將實驗動物分為6組：空白組、乙醇組、模型組(3、7、14、21 d)，每組10只?？瞻捉M不處理，模型組均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合試劑灌腸，乙醇組50%乙醇0.25 ml灌腸。分別于制模后3、7、14、21 d分批處死大鼠并取材，乙醚麻醉后于股動脈采血，室溫靜置10～20 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清，檢測指標。脫頸處死大鼠，剖取病變最嚴重處結腸5～8 cm，用冷 PBS清洗結腸，肉眼觀察結腸損傷情況并評分。

1.4.3結腸大體形態(tài)損傷評分大體形態(tài)損傷參照Luketal標準 0分：無損傷；1分：充血但沒有潰瘍；2分：充血而且腸壁變厚但沒有潰瘍；3分：有一處小潰瘍，直徑約0～1 cm；4分：潰瘍較大，直徑約1～2 cm，但腸管與外周臟器無粘連；5分：潰瘍直徑1～2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴重。

1.4.4指標檢測采用ELISA法測定IL-1β、TNF-α，IL-4嚴格按試劑盒要求操作。在檢測波長450 nm和校正波長620 nm同時讀板，通過標準曲線，計算各樣本含量。

1.5統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1一般狀況各組大鼠造模后第1天均出現(xiàn)懶動，扎堆，食量下降，稀便且部分大鼠出現(xiàn)血便；第3天體重開始下降；第7天體重下降明顯，毛色無光澤，食量低于正常，仍有稀便；第14天大鼠活動正常，仍有稀便；第21天造模各大鼠毛色晦暗，飲食趨于正常，時有稀便。乙醇組造模后第1天出現(xiàn)稀便，于第2天癥狀緩解，第3天體重出現(xiàn)增長，7 d后完全恢復正常。

2.2結腸組織大體形態(tài)及評分空白組和乙醇組大鼠腸道不增厚，無粘連，腸皺襞紋理清晰，腸黏膜光滑，未見明顯的充血水腫、糜爛及潰瘍。各造模組與乙醇組(0.13±0.35)和空白組(0.10±0.11)相比較，均有顯著差異(P<0.01)。3 d組(1.33±0.98)大鼠腸壁可見明顯充血水腫，腸壁增厚，潰瘍形成；7 d組(2.62±0.87)可見腸道粘連，結腸縮短，黏膜壞死，呈黑褐色，亦有大鼠可見腸脹氣；14 d組(2.17±0.83)潰瘍開始愈合，大鼠腸道仍然有粘連，偶有腸脹氣出現(xiàn)；21 d組(1.85±0.68)潰瘍面積較7 d組變小，可見愈合后的瘢痕，各大鼠腸壁仍有增厚變硬及腸道粘連，與7 d組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3UC大鼠血清IL-β的動態(tài)表達與空白組和乙醇組比較，各模型組大鼠血清IL-β顯著增高，其中以7 d組升高最為明顯(P<0.01)；與3 d組比較，7 d組IL-β水平升高達到最高值；與7 d或14 d比較，21 d組IL-β水平又明顯下降(P<0.05)。見表1。

2.4UC大鼠血清TNF-α的動態(tài)表達與空白組和乙醇組比較，各模型組大鼠血清TNF-α含量明顯升高(P<0.01，P<0.05)，其中尤其以14 d組升高更為顯著(P<0.01)。與7 d或14 d比較，21 d組TNF-α含量又明顯下降(P<0.05)。見表1。

2.5UC大鼠血清IL-4的動態(tài)表達與空白組和乙醇組比較，各模型組大鼠血清IL-4含量明顯下降(P<0.01，P<0.05)，其中尤其以14 d組下降更為顯著(P<0.01)。與7 d或14 d比較，21 d組IL-4含量又明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1　UC大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-4

與空白組和乙醇組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與3 d組比較：3)P<0.01；與7 d或14 d比較：4)P<0.05

3討論

腸黏膜持續(xù)的炎癥損傷和免疫異常被認為是UC發(fā)病的基本機制〔2〕。細胞因子失衡是UC產生腸道非特異性炎性反應的關鍵環(huán)節(jié)〔3〕。參與炎癥反應的細胞因子分為促炎和抗炎兩類。TNF-α在UC發(fā)病中被公認為是一種促炎細胞因子，它可以促使腸上皮內淋巴細胞增殖、移行和分化，在這一過程中會釋放大量的非特異性或特異性炎性分子，在腸黏膜局部起到免疫破壞作用，反映到UC則是腸黏膜局限性潰瘍、炎細胞的出現(xiàn)和延續(xù)?；顒悠赨C患者血清TNF-α水平明顯增高,提示TNF-α參與了UC的病理過程〔4〕。TNF-α主要由激活的單核細胞和巨噬細胞產生，其促炎機制主要是參與激活中性粒細胞和上調黏附分子、促進肉芽腫的形成。TNF-α還能夠加強單核巨噬細胞的吞噬功能，刺激IL-8、IL-1等其他細胞因子合成釋放，產生細胞因子的瀑布效應，促進炎癥反應的擴大〔5〕。本實驗證實了TNF-α的動態(tài)表達與UC的發(fā)病和加重呈正相關。

IL-1β是誘導炎癥性腸病(IBD)腸道炎癥的一種非常重要的細胞因子，它能使CD4+T細胞活化，促進B細胞生長、活化以及IL-2R表達，引起炎癥介質釋放〔6〕。IL-1受體拮抗劑IL-1Ra可以通過競爭結合靶細胞上的IL-1受體，阻斷IL-1的促炎效應。但UC患者IL-1Ra和IL-1β嚴重失衡，腸上皮細胞只分泌的IL-1Ra，不足以中和由固有膜單核細胞分泌的IL-1β等炎性細胞因子〔7〕，所以，在UC患者會因為腸黏膜IL-1β的大量分泌促使炎癥持續(xù)和加重。IL-1β有多種生物學效應，IL-1β能夠使免疫上調和促進炎癥活性，能通過自分泌或旁分泌促進其下游細胞因子(如TNF-α)的表達和產生，并和其共同作用，引起一系列腸黏膜損傷和腸道炎癥反應。IL-1β還通過促進白細胞黏附分子的表達，趨化中性粒細胞等炎性細胞進入腸道病變部位，引發(fā)一系列腸組織破壞和腸道炎癥反應〔8〕。

有研究表明〔9〕，UC患者腸黏膜IL-4能抑制殺傷細胞的活性，并抑制腸黏膜固有層單核細胞的增殖，緩解其細胞毒性。體外實驗已經(jīng)證明〔10〕，IL-4能抑制炎癥介質IL-1β、TNF-α的釋放，從而抑制IL-1、TNF-α的促炎作用。

本實驗說明IL-1β、TNF-α、IL-4的表達與結腸病理損傷有著高度一致性，IL-1β、TNF-α、IL-4的動態(tài)表達與UC 的發(fā)生和嚴重程度呈正相關。本實驗也證實UC的發(fā)病機制之一是抗炎因子與抑炎因子的平衡遭到了破壞，所以從糾正腸道異常免疫反應角度研制治療UC的新藥應該是非常重要的思路。

4參考文獻

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〔2013-06-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)