二氮嗪預(yù)處理對Aβ1～42作用神經(jīng)元NR2B亞基蛋白表達(dá)的影響

二氮嗪預(yù)處理對Aβ1～42作用神經(jīng)元NR2B亞基蛋白表達(dá)的影響

夏春鳳李艷菊朱瑾杜怡峰馬國詔張鏞

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東濟(jì)南250021)

摘要〔〕目的研究ATP敏感的鉀離子通道開放劑二氮嗪(diazoxide)預(yù)處理對Aβ1～42作用原代培養(yǎng)神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體2B(NR2B)亞基蛋白表達(dá)的影響。方法原代培養(yǎng)大鼠皮層海馬神經(jīng)元并進(jìn)行鑒定，將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、單純Aβ1～42干預(yù)組、二氮嗪預(yù)處理1h后Aβ1～42干預(yù)組(Aβ1～42+diazoxide)、單純二氮嗪預(yù)處理組，并采用免疫印跡檢測不同時間點(24 h、72 h)細(xì)胞NR2B亞基蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果Aβ1～42(2 μmol/L)作用神經(jīng)元24 h后，與對照組相比，單純Aβ1～42干預(yù)組和Aβ1～42+diazoxide組的NR2B亞基蛋白表達(dá)均無明顯改變。Aβ1～42作用神經(jīng)元72 h后，與對照組比較，單純Aβ1～42組NR2B亞基蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；而與單純Aβ1～42干預(yù)組相比，Aβ1～42+diazoxide組NR2B亞基蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論Aβ1～42作用原代培養(yǎng)神經(jīng)元72 h，能夠顯著增加神經(jīng)細(xì)胞NR2B亞基蛋白的表達(dá)量；同時，二氮嗪能拮抗Aβ1～42所引起的NR2B亞基蛋白表達(dá)量升高，提示二氮嗪可能通過NMDA受體通路影響Aβ1～42的細(xì)胞毒性作用。

關(guān)鍵詞〔〕二氮嗪；Aβ1～42；NMDA受體；NR2B亞基

中圖分類號〔〕R329.21〔

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(30870874；30600202)

通訊作者：馬國詔(1973-)，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事研究老年性癡呆和帕金森病發(fā)病機(jī)制與防治研究。

張鏞(1962-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年性癡呆和腦血管疾病防治研究。

第一作者：夏春鳳(1988-)，女，碩士，主要從事老年性癡呆發(fā)病機(jī)制與防治研究。

Effects of ATP sensitive potassium channel opener diazoxide on neural NR2B subunit protein expression induced by Aβ1～42

XIA Chun-Feng, LI Yan-Ju, ZHU Jin,etal.

Department of Neurology, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, Shandong, China

Abstract【】ObjectiveTo study the effects of pretreatment of ATP sensitive potassium channel opener diazoxide on neural NR2B subunit protein expression induced by Aβ1～42.MethodsThe primary neurons were cultured and evaluated, then neurons were randomly divided into control group, Aβ1～42 treatment group, diazoxide pretreatment for 1 h +Aβ1～42 group(Aβ1～42+ diazoxide) and simple diazoxide group, the protein expression level of NR2B subunit was determined by Western blotting for different times(24 h and 72 h).ResultsBeing exposed to Aβ1～42 for 24 h, compared with the control group, the protein expression level of NR2B subunit of both Aβ1～42 group and Aβ1～42+ diazoxide group have no significant difference. However, compared with control group, the protein expression level of NR2B subunit of Aβ1～42 group significantly increases for 72 h(P<0.05); Compared with Aβ1～42 group, the protein expression level of NR2B subunit of Aβ1～42+diazoxide group significantly decreases(P<0.05).ConclusionsAβ1～42 could increase the protein expression level of NR2B subunit in cultured primary neurons for 72 h, and ATP sensitive potassium channel opener diazoxide could inhibit the increasing of protein expression level of NR2B subunit induced by Aβ1-42, it is indicated that diazoxide might affect Aβ1～42-induced cytotoxicity via NMDA receptor pathway.

【Key words】Diazoxide; Aβ1～42; N-methyl-D-aspartate receptor; NR2B subunit

研究證實β-淀粉樣蛋白(Aβ)神經(jīng)細(xì)胞毒性機(jī)制之一可能與N-甲基-D-天(門)冬氨酸(NMDA)受體活性密切相關(guān)〔1〕。NMDA受體是腦內(nèi)重要的離子型谷氨酸受體，廣泛參與神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞、突觸可塑性以及長時程增強(qiáng)等許多生理及病理過程，其中NMDA受體的NR2B亞基對NMDA受體藥理和功能特性起決定作用，是一個治療與NMDA受體相關(guān)疾病的潛在靶點〔2〕。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的ATP敏感性鉀離子通道(KATP)激活在阿爾茨海默病(AD)中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用。選擇性的KATP通道開放劑二氮嗪(diazoxide)可明顯降低Aβ寡聚體聚集和Tau蛋白過磷酸化，且能改善轉(zhuǎn)基因AD鼠模型的認(rèn)知功能障礙〔3〕；而且二氮嗪預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)Aβ1～42作用神經(jīng)元導(dǎo)致的KATP通道亞基過表達(dá)和離子流改變，抵抗Aβ1～42的神經(jīng)細(xì)胞毒性，防治神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔4～6〕。但是，目前尚未見有關(guān)二氮嗪拮抗Aβ細(xì)胞毒性與NR2B亞基之間的報道。本研究旨在探討二氮嗪對Aβ1～42作用于原代培養(yǎng)神經(jīng)元NR2B亞基蛋白表達(dá)的影響，為探索AD新的靶向藥物提供基本理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料新生1 d內(nèi)Wistar大乳鼠，雌雄不限，由山東大學(xué)實驗動物研究中心提供；Aβ1～42、二氮嗪、多聚賴氨酸均購自美國Sigma公司；胎牛血清、B27 supplement及Neurabasal培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自?？寺」荆煌每勾笫驨MDAR-2B一抗多克隆抗體購自英國Abcam公司；羊抗兔二抗購自中杉公司；羊抗大鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和相應(yīng)標(biāo)記二抗均購自美國Santa Cruz公司；二甲基亞砜購自上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代培養(yǎng)大腦皮層海馬神經(jīng)元選用新生1 d的Wistar大乳鼠，75%酒精消毒，用顯微鑷子在無菌操作下分離出大腦皮層及海馬置于D-Hank液中，去腦膜，將腦組織剪成碎塊，0.125%胰酶37℃消化15 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打均勻，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心10 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，接種于涂有多聚賴氨酸的12孔板(接種密度6×105/ml)及培養(yǎng)皿(接種密度2×106/ml)中，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。第二天換含2% B27的Neurabasal培養(yǎng)液，每隔2 d半量換液1次，第7天加藥處理。

1.2.2皮層海馬膽堿能神經(jīng)元的鑒定是突觸前的膽堿合成標(biāo)志酶，利用ChAT的抗體作為膽堿能神經(jīng)的標(biāo)志物鑒定膽堿能神經(jīng)元。神經(jīng)元在爬片的第7天用ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒定，鏡下觀察膽堿能陽性神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色著色。

1.2.3實驗分組及藥物處理Aβ1～42人工重組蛋白質(zhì)0.1 mg，溶10 μl DMSO(DMSO濃度<1‰)中，配成濃度為221 μmol/L，100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)稀釋，即為原液。將原液置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育72 h，進(jìn)行老化處理，4℃貯存?zhèn)溆茫脮r混勻。實驗分為對照組、單純Aβ1～42干預(yù)組、二氮嗪預(yù)處理1 h后Aβ1～42干預(yù)組(Aβ1～42+diazoxide組)、單純二氮嗪預(yù)處理組，各組又分為24、72 h兩個亞組。細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，Aβ1～42干預(yù)組加入含Aβ1～42(2 μmol/L)的培養(yǎng)液；二氮嗪預(yù)處理后Aβ1～42干預(yù)組為二氮嗪(50 μmol/L)預(yù)處理1 h后加入Aβ1～42(2 μmol/L)共同作用，單純二氮嗪預(yù)處理組為二氮嗪(50 μmol/L)預(yù)處理1 h后加等量的PBS和培養(yǎng)液，對照組加等量的PBS和培養(yǎng)液，分別孵育24、72 h。

1.2.4Western印跡檢測各組NR2B亞基蛋白的表達(dá)Aβ1～42作用神經(jīng)細(xì)胞24 h和72 h后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌3次，加入適量的RIPA裂解液冰浴中裂解細(xì)胞，收集蛋白，BCA法蛋白定量，取60 μg總蛋白上樣，行8%SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗(兔抗大鼠NR2B多克隆抗體1∶100)于4℃孵育過夜，用TBST緩沖液洗滌3×10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)室溫孵育1 h，再用TBST緩沖液洗滌3×10 min，加入發(fā)光試劑ECL顯色，以β-actin作內(nèi)參照，用圖像分析軟件Band Scan進(jìn)行光密度積分值分析。

2結(jié)果

2.1Western印跡檢測Aβ1～42與二氮嗪作用神經(jīng)元24 h后NR2B亞基蛋白的表達(dá)單純Aβ1～42(2 μmol/L)作用神經(jīng)元24 h后，NR2B亞基蛋白表達(dá)(0.66±0.04)與對照組(0.61±0.06)相比沒有明顯變化(P>0.05)；二氮嗪預(yù)處理細(xì)胞1 h后Aβ1～42共同作用24 h，NR2B亞基蛋白表達(dá)(0.58±0.04)較單純Aβ1～42干預(yù)組沒有明顯改變(P>0.05)，單純二氮嗪預(yù)處理組為(0.63±0.09)。見圖1。

2.2不同濃度Aβ1～42作用神經(jīng)細(xì)胞72 h后NR2B亞基蛋白表達(dá)量改變對照組、2.5、10 μmol/L Aβ1～42組NR2B亞基蛋白表達(dá)分別為0.53±0.11，0.98±1.11；1.24±0.13，1.94±0.14。隨著Aβ1～42作用濃度的不斷增高，NR2B亞基蛋白表達(dá)量呈濃度依賴性逐漸升高(P<0.05)。見圖2。

2.3Western印跡檢測Aβ1～42與二氮嗪作用神經(jīng)元72 h后NR2B亞基蛋白的表達(dá)圖3可見，單純Aβ1～42作用72 h后，NR2B亞基蛋白表達(dá)(1.05±0.08)較對照組(0.77±0.09)顯著升高(P<0.05)；Aβ1～42+diazoxide組NR2B亞基蛋白表達(dá)(0.62±0.07)與單純Aβ1～42干預(yù)組明顯降低(P<0.05)；單純二氮嗪干預(yù)組NR2B亞基蛋白表達(dá)(0.57±0.08)較對照組無明顯差異(P>0.05)。

1～4分別為對照組、單純Aβ 1～42干預(yù)組、Aβ 1～42+ diazoxide組、單純二氮嗪預(yù)處理組 圖1　免疫印跡檢測Aβ 1～42及二氮嗪處理細(xì)胞 24 h后各組NR2B亞基蛋白表達(dá)變化

圖2　不同濃度Aβ 1～42作用神經(jīng)元72 h后NR2B 亞基蛋白表達(dá)量

1～4分別為對照組、單純Aβ 1～42干預(yù)組、Aβ 1～42+ diazoxide組、單純二氮嗪干預(yù)組 圖3　免疫印跡檢測Aβ 1～42及二氮嗪處理細(xì)胞72 h 后各組NR2B亞基蛋白表達(dá)變化

3討論

阿爾茨海默病(AD)是癡呆中最常見的一種類型，其臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知功能障礙和精神行為異常。Aβ級聯(lián)反應(yīng)假說認(rèn)為Aβ沉積在AD發(fā)病機(jī)制中起著核心作用，線粒體的功能障礙、Tau蛋白的過度磷酸化和神經(jīng)元的凋亡、突觸的降解消失等均與Aβ的生成與聚集有關(guān)〔7〕。一些研究表明，AD患者早期的記憶和認(rèn)知功能的缺失與可溶的Aβ寡聚體誘導(dǎo)的突觸功能改變有關(guān)。通過毒理學(xué)模型觀察到Aβ寡聚體可以導(dǎo)致神經(jīng)元樹突棘的廣泛損傷，降低突觸傳遞、減弱突觸聯(lián)系并引起海馬區(qū)神經(jīng)元的興奮性中毒〔8〕。目前，Aβ對突觸可塑性損傷的具體作用機(jī)制尚無定論，研究發(fā)現(xiàn)與谷氨酸能系統(tǒng)激活有密切關(guān)系。Aβ能降低星形細(xì)胞對谷氨酸的再攝取，并影響谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(GLT-1)和谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運體(GLAST)的活性功能，從而導(dǎo)致突觸間隙谷氨酸濃度的異常增高，進(jìn)而引起了NMDA受體的持續(xù)性興奮〔9〕。Mattson等〔10〕還發(fā)現(xiàn)Aβ與NMDA受體間存在直接關(guān)系，Aβ能直接增強(qiáng)NMDA受體介導(dǎo)的興奮毒性作用，并在海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)NMDA受體激活后表現(xiàn)胞內(nèi)Ca2+含量的大幅度增加，并且發(fā)生NMDA受體激活易化現(xiàn)象。因此NMDA受體介導(dǎo)的谷氨酸興奮毒性在Aβ誘導(dǎo)突觸可塑性損傷中發(fā)揮重要作用。

NMDA受體是典型的異構(gòu)復(fù)合體,由NR1亞單位與NR2亞單位(NR2A-NR2D)構(gòu)成。NR1是NMDA受體的基本亞基，是實現(xiàn)通道功能所必需的；NR2是調(diào)節(jié)亞基，輔助NMDA受體實現(xiàn)多元化結(jié)構(gòu)，其中NR2B對NMDA受體的結(jié)構(gòu)和功能有十分重要的作用。離體實驗表明NR2B亞基可調(diào)節(jié)NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電位，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性〔11〕，同時含NR2B的NMDA受體離子通道對Ca2+有較高的通透性〔12〕。

本實驗研究提示Aβ能夠改變NMDA受體復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能，尤其是改變NMDAR1/NMDAR2B型NMDA受體復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能，從而進(jìn)一步激活NMDA受體，引起胞外Ca2+內(nèi)流增加，胞內(nèi)鈣超載，參與NMDA介導(dǎo)的細(xì)胞興奮毒性損傷和突觸可塑性破壞過程〔13〕。

ATP敏感性鉀通道(KATP)廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在生理狀態(tài)下通道處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度降低和(或)氧化應(yīng)激損傷時，此通道激活，通過感受細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP水平直接將細(xì)胞代謝狀態(tài)與電活動相偶聯(lián)，對早期的細(xì)胞能量代謝障礙可能產(chǎn)生的細(xì)胞線粒體等損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。KATP 通道分為兩類：一類是存在于細(xì)胞膜上的ATP 敏感性鉀離子通道(SarcKATP),另一類是線粒體ATP 敏感性鉀離子通道(MitoKATP)，其中MitoKATP通道被認(rèn)為是抗細(xì)胞損傷的共同效應(yīng)器〔14〕。二氮嗪是目前常用的MitoKATP通道特異性開放劑，它對MitoKATP通道的開放作用是SarcKATP通道的2 000倍。研究發(fā)現(xiàn)，在AD鼠模型中，二氮嗪預(yù)處理能部分改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔3〕，并能使大鼠大腦皮層和海馬部位神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)量增加而Caspase-3的表達(dá)量降低，可能具有抗細(xì)胞凋亡作用〔15〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，二氮嗪能增強(qiáng)谷氨酸轉(zhuǎn)運體的功能,進(jìn)而促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取、降低谷氨酸興奮性毒性〔16〕。Teshima等〔17〕研究報道,二氮嗪預(yù)處理可抑制小腦顆粒細(xì)胞興奮性谷氨酸的釋放,并認(rèn)為其可能是通過MitoKATP通道的激活來實現(xiàn)的。

本實驗結(jié)果提示Aβ能夠改變NMDA受體復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能，參與NMDA介導(dǎo)的細(xì)胞興奮毒性損傷和突觸可塑性破壞過程〔13〕。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二氮嗪具有拮抗Aβ1～42升高NR2B亞基蛋白表達(dá)的作用，提示二氮嗪可能通過影響NMDA受體復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能而拮抗Aβ1～42的細(xì)胞毒性作用，但其具體分子信號機(jī)制正在研究中。

ATP敏感性鉀通道(KATP)可能是腦對各種氧化應(yīng)激預(yù)適應(yīng)的一個觸發(fā)器和/或效應(yīng)器，KATP通道開放劑作為腦保護(hù)劑已經(jīng)成為科研靶點〔18〕，本實驗證實KATP開放劑二氮嗪預(yù)處理拮抗了Aβ1～42升高NR2B亞基蛋白表達(dá)的作用，但是NR2B亞單位結(jié)構(gòu)和功能改變在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制和藥物防治中具體分子機(jī)制仍不清楚，有望為研制新型抗AD藥物提供基本理論依據(jù)。

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〔2013-12-28修回〕

(編輯徐杰)