慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中核轉錄因子-κB、轉化生長因子-β1表達與氣道重塑的關系

慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中核轉錄因子-κB、轉化生長因子-β1表達與氣道重塑的關系

管頻1于化鵬2李偉1吳智勇1吳潔3陳世良1

(南方醫(yī)科大學研究生物學院，廣東廣州510000)

摘要〔〕目的觀察COPD患者肺組織中核轉錄因子(NF)-κB、轉化生長因子(TGF)-β1的表達及與氣道重塑的相關性。方法標本取自40例因肺部孤立性結節(jié)行肺葉切除術患者的肺組織，按術前肺功能分為非COPD組(A 組，20例) 及COPD組(B組，20例)。所取肺組織HE染色后光鏡下觀察肺組織的病理形態(tài)學改變,以半定量圖像分析法測量小氣道管壁和平滑肌層厚度。用Western印跡法檢測肺組織中NF-κB、TGF-β1的表達。結果①B組NF-κB、TGF-β1表達均高于A組(均P<0.05)，且NF-κB與TGF-β1表達存在正相關(P<0.05)；②肺組織中NF-κB、TGF-β1的表達與單位長度的管壁面積(WAt/Pi,μm2/μm)及單位長度的平滑肌層面積(WAsm/Pi,μm2/μm) 表達均呈正相關(P<0.05)。③FEV1/ FVC、FEV1%預計值分別與NF-κB、TGF-β1的表達呈負相關(P<0.05)。結論COPD肺組織中NF-κB、TGF-β1的表達增加，細胞因子的表達增加使其發(fā)揮的生物學效應增強，從而促進氣道重塑，進一步影響肺功能。

關鍵詞〔〕慢性阻塞性肺疾病(COPD)；氣道重塑；轉化生長因子-β1；核轉錄因子-κB

中圖分類號〔〕R56〔

基金項目：海南省自然科學基金(807081)

通訊作者：于化鵬(1960-)，男，博士生導師，教授，主要從事支氣管哮喘發(fā)病機制研究。

1海南省人民醫(yī)院醫(yī)療保健四區(qū)

2南方醫(yī)科大學附屬珠江醫(yī)院呼吸內科3海南醫(yī)學院

第一作者：管頻(1980-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事慢性阻塞性肺疾病氣道重塑研究。

氣道重塑是慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣流受限的主要病理基礎,是COPD病變呈持續(xù)發(fā)展的關鍵因素〔1，2〕。 在眾多炎癥因子及細胞外基質調節(jié)因子中，轉化生長因子(TGF)-β1是同時具有重要的免疫調節(jié)和致纖維化活性，故而在氣道炎癥及氣道重塑中占重要地位〔3〕。核轉錄因子(NF)-κB是在肺組織氧化應激、細胞凋亡中活化的主要轉錄因子，它能夠引起許多致炎癥基因的表達上調，從而影響了氣道炎癥及氣道重塑〔4〕。本文探討TGF-β1、 NF-κB的表達與氣道重塑指標的相關性。

1材料與方法

1.1資料選取2009年3～7月因發(fā)現(xiàn)肺部孤立性結節(jié)于我院胸外科住院擬行行肺葉切除術的40例患者，入選患者近6 w內無急性加重。按術前1 w的肺功能結果分為非COPD組(A組，20例)及與COPD組(B組，20例)。COPD的診斷符合COPD診治指南〔1〕。兩組患者的年齡、性別等無明顯差異?；颊呔庀忍煨孕呐K病、左心疾病、COPD以外的其他肺疾病以及全身其他系統(tǒng)慢性病變。實驗所需的肺組織取遠離肺癌病灶5 cm以上、無腫瘤浸潤的外周肺組織。兩組受試者性別、年齡之間無明顯差異(P>0.05)。見表1。

1.2標本采集及HE染色處理手術取下肺組織標本,迅速用10%福爾馬林充分浸泡固定12 h,常規(guī)梯度酒精脫水,石蠟包埋。取上述人肺組織石蠟塊,切片(5 μm) ,HE染色后,光鏡下觀察其病理形態(tài)學改變。

表1　兩組受試者一般資料及肺功能比較

1.3支氣管形態(tài)學測量方法隨機選取HE切片中內周長<1 000 μm,長徑/短徑≤2,較規(guī)整的小支氣管,每個標本選3～6個支氣管橫截面積,采用META MORPH 圖像分析系統(tǒng)(美國Universal Imaging Corporation) 進行測量和計算，以單位長度的管壁面積表示管壁厚度,同樣以單位長度的平滑肌層面積表示平滑肌層厚度〔5〕。

1.4Western印跡檢測外周氣道肺組織TGF-β1、NF-κB蛋白質表達采用Western印跡法檢測外周氣道肺組織的NF-κB p65(分子量65 kD)、TGF-β1(分子量12.5 kD)的表達，以GAPDH為內參蛋白(分子量36 kD)。應用RIPA蛋白裂解液從肺組織中提取蛋白質,考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度后于-80 ℃保存。取核蛋白樣品加等體積的2×電泳樣品緩沖液加熱變性后,以20 μg蛋白/泳道上樣,經10% SDS-PAGE電泳后,電轉移至硝酸纖維膜。予麗春紅S染色確定轉膜情況并標記蛋白質標準參照物位置。用5%脫脂奶粉封閉后,先后加入一抗(NF-κB p65抗體或TGF-β1抗體)及辣根過氧化物酶標記的二抗,DAB顯色劑顯色,結果:陽性區(qū)域顯深棕色。拍攝濾膜照片,并通過凝膠成像系統(tǒng)定量掃描灰度值，NF-κB p65/GAPDH吸光度比值來表示。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行t及χ2檢驗。

2結果

2.1兩組肺組織TGF-β1、NF-κB表達比較TGF-β1和NF-κB表達在B 組均明顯高于A組(P<0.05)。見表2，圖1。

2.2兩組支氣管形態(tài)學測量結果比較管壁厚度、平滑肌厚度在B組均明顯高于A組(P<0.05)。見表2。

2.3相關分析COPD患者外周肺組織TGF-β1表達與NF-κB的表達正相關(r=0.783,P=0.000)。NF-κB的表達與管壁厚度、平滑肌厚度以及肺功能指標FEV1/ FVC、FEV1%預計值均正相關(r值分別為：0.882、0.629、0.797、0.738，P值均0.000),TGF-β1與管壁厚度、平滑肌厚度以及肺功能指標FEV1/ FVC、FEV1%預計值均正相關(r值分別為：0.752、0.694、0.968、0.706,P值均0.000)。

圖1　Western印跡法檢測兩組肺組織NF-κB、TGF-β1表達

組別TGF-β1NF-κB管壁厚度(μm2/μm)平滑肌厚度(μm2/μm)A組2.93±0.738.68±3.6758.16±9.836.75±1.79B組5.07±0.6022.69±7.8381.46±8.3814.87±4.11t/P值10.156/0.0007.244/0.0008.065/0.0008.102/0.000

3討論

COPD是肺組織對于有害顆?；驓怏w產生的異常炎性免疫反應相關的復雜綜合征，大量的實質、炎癥細胞和細胞因子參與了COPD的發(fā)生和發(fā)展過程〔6〕。在氣道炎癥和氣道重塑中，TGF-β1在細胞外基質活化后，通過smad依賴或非依賴信號轉導途徑，TGF-β1調節(jié)不同類型細胞的功能，例如Tp、Th17，特別是Treg(調節(jié)性T細胞)及成纖維細胞來促進炎癥反應、合成細胞外基質蛋白及促進膠原沉積等〔3〕，從而引起氣道修復、重塑，也就是說，TGF-β1是氣道重塑的閥門，是這個過程的關鍵。已有研究發(fā)現(xiàn)， COPD患者氣道上皮及肺泡巨噬細胞中TGF-β1表達增加，且隨吸煙量增多而升高〔7，8〕；且COPD患者TGF-β1的表達水平與小氣道阻塞程度有關，在外周氣道的狹窄、纖維化中起到重要作用〔9，10〕。而本實驗發(fā)現(xiàn)，COPD患者外周肺組織中TGF-β1表達均明顯高于非COPD者,并與管壁厚度、平滑肌厚度及肺功能呈正相關，這與以前關于TGF-β1在COPD患者氣道重塑中的重要作用的研究是一致的。

NF-κB參與許多炎性因子的基因調控，例如白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α,ET-1、ICAM-1及生長因子等〔11〕。在TGF的上游啟動子上也存在著NF-κB反應元件〔12〕，有研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞彈性蛋白酶通過NF-κB途徑誘導了人氣道平滑肌TGF-β1的表達〔13〕。另一方面，也有研究發(fā)現(xiàn)TGF-1的活化因子組織轉谷氨酰胺酶(tTG)基因的啟動子中含有NF-κB的結合位點，因而NF-κB能從多方面上調TGF-β1的表達〔14〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，COPD病程中,NF-κB可能啟動了TGF-β1基因的轉錄,上調了TGF-β1的表達，進一步發(fā)揮生長因子的多方面效應，促進氣道重塑而影響肺功能。

4參考文獻

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〔2013-08-20修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)