地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的影響

劉 靜，劉 梅，楊 波，馬 靜，魯 毅，邱 彥

（解放軍454醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210002）

地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的影響

劉 靜，劉 梅，楊 波，馬 靜，魯 毅，邱 彥

（解放軍454醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210002）

目的：觀察地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響，初步探討其可能的作用機(jī)理。方法：采用氧嗪酸鉀腹腔注射誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠模型，將成模小鼠隨機(jī)分為模型組、地黃提取物低（2 g·kg-1）、中（4 g·kg-1）、高（8 g·kg-1）劑量組和別嘌醇（20 mg·kg-1）組。對(duì)小鼠血清尿酸、肌酐、一氧化氮，肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）和腺苷脫氨酶（ADA）等指標(biāo)進(jìn)行觀察分析，并對(duì)小鼠腎臟進(jìn)行病理檢查。結(jié)果：給藥干預(yù)14 d后，與模型組比較，地黃提取物中、高劑量組均可顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸、肌酐含量（P ＜ 0.01），顯著升高一氧化氮水平（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01），并可顯著抑制高尿酸血癥小鼠肝臟XOD活性（P ＜ 0.01）。地黃提取物高劑量組對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟ADA活性有顯著的抑制作用（P ＜ 0.05）。病理檢查結(jié)果顯示，地黃提取物三個(gè)劑量組的腎臟組織病變程度要明顯輕于模型組。結(jié)論：地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠具有降低血清尿酸水平作用，其機(jī)制與抑制肝臟XOD和ADA活性有關(guān)。

地黃提取物；高尿酸血癥；尿酸；黃嘌呤氧化酶；腺苷脫氨酶；小鼠

高尿酸血癥又稱為痛風(fēng)，是一種嘌呤代謝異常及紊亂所致的疾病，其臨床特點(diǎn)為高尿酸血癥及由此引起的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作、痛風(fēng)石沉積，痛風(fēng)石性慢性關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)畸形，常累及腎臟而引起慢性間質(zhì)性腎炎和形成尿酸結(jié)石。高尿酸血癥已成為一種常見疾病，與肥胖癥、高脂血癥、高血壓、糖尿病、動(dòng)脈硬化、冠心病、尿路感染、腎功能衰竭等發(fā)病密切相關(guān)[1]，嚴(yán)重危害人類健康，并且近年來其發(fā)病率在全球大部分地區(qū)及我國均逐年上升[2]。因此，對(duì)高尿酸及痛風(fēng)的防治研究日益重要。

地黃含梓醇、小檗堿、藥根堿、木蘭花堿、地黃堿等有效成分，其作為中藥使用已有上千年歷史，主要功效為降血糖、止血、強(qiáng)心、利尿、抗炎免疫和保肝等。本實(shí)驗(yàn)采用氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)急性高尿酸血癥小鼠模型，觀察地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸、肌酐、一氧化氮水平以及肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）與腺苷脫氨酶（ADA）活性的影響，以期為其治療高尿酸血癥和痛風(fēng)藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，60只，18 ～ 20 g，SPF級(jí)，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。在室溫22 ～ 26 ℃、濕度40% ～ 70%的動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，光照時(shí)間隨自然變化，自由飲食飲水。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品及試劑

地黃提取物（梓醇含量≥94.8%，常州千杏生物科技有限公司）；別嘌醇片（上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.1 g，批號(hào)130301）；氧嗪酸鉀（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)SF0328GD13）?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測試盒（批號(hào)20141115）、黃嘌呤氧化酶測定試劑盒（批號(hào)20141026）、腺苷脫氨酶測定試劑盒（批號(hào)20140717）、尿酸測定試劑盒（批號(hào)20140606）、肌酐（批號(hào)20140717）、一氧化氮（批號(hào)20140717）均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BTS-370plus型全自動(dòng)生化分析儀（西班牙BioSystems公司）；TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；梅特勒AL140電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Thermo Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；DY89-Ⅰ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Leica RM2135滑動(dòng)切片機(jī)（德國Leica公司）；Olympus DM750光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

軻左手把秦王袖，右手揕其胸，數(shù)之曰：“足下負(fù)燕日久，貪暴海內(nèi)，不知厭足。于期無罪而夷其族。軻將海內(nèi)報(bào)仇。今燕王母病，與軻促期。從吾計(jì)則生，不從則死?！鼻赝踉唬骸敖袢罩?，從子計(jì)耳!乞聽琴聲而死?！闭偌斯那伲俾曉唬骸傲_縠單衣，可掣而絕。八尺屏風(fēng)，可超而越。鹿盧之劍，可負(fù)而拔。”軻不解音。秦王從琴聲負(fù)劍拔之，于是奮袖超屏風(fēng)而走。軻拔匕首擿之，決秦王，刃入銅柱，火出。秦王還斷軻兩手。軻因倚柱而笑，箕踞而罵曰：“吾坐輕易，為豎子所欺。燕國之不報(bào)，我事之不立哉！”

將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。分別為空白對(duì)照組、模型（高尿酸血癥）組、陽性藥別嘌醇（20 mg·kg-1）組、地黃提取物低劑量（2 g·kg-1）組、中劑量（4 g·kg-1）組和高劑量（8 g·kg-1）組，給藥體積為0.2 mL·10 g-1小鼠體重?？瞻讓?duì)照和模型組灌胃給予等體積的0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)灌胃給藥14 d，每天1次，末次于造模1 h后給藥。

2.2 高尿酸血癥小鼠模型的建立[3-4]

選用氧嗪酸鉀鹽為化學(xué)誘導(dǎo)劑，抑制尿酸酶活性，抑制小鼠體內(nèi)尿酸分解，增高血清尿酸水平，造成高尿酸血癥小鼠模型。于末次給藥前1 h，小鼠腹腔注射300 mg·kg-1氧嗪酸鉀鹽，空白對(duì)照組腹腔注射相應(yīng)體積0.9%氯化鈉注射液。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1血清尿酸、肌酐和一氧化氮水平檢測 末次給藥1 h后，小鼠摘眼球后取血，全血3000 r·min-1，離心10 min，取血清置于4 ℃冰箱中，待測尿酸、肌酐、一氧化氮含量。參照試劑盒方法操作進(jìn)行尿酸、肌酐、一氧化氮含量的檢測。

2.3.2肝臟XOD及ADA活性測定 放血處死小鼠后，快速取肝臟組織塊，立即投入液氮中速凍，取出后置于– 80 ℃冰箱中保存，待測肝臟XOD及ADA活性。肝臟組織塊稱重后，按重量體積比加入9倍量預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液制成10%組織勻漿液，2500 r·min-1離心10 min，取上清按照試劑盒方法測定組織勻漿液蛋白含量、XOD和ADA活性。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的尿酸、肌酐和一氧化氮水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組高尿酸血癥小鼠的尿酸、肌酐含量顯著升高，一氧化氮水平顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），說明高尿酸血癥小鼠模型造模成功。與模型組相比，地黃提取物中、高劑量組和別嘌醇組均可不同程度抑制氧嗪酸鉀鹽引起的高尿酸血癥小鼠的尿酸和肌酐水平的升高（P ＜ 0.01），同時(shí)升高高尿酸血癥小鼠一氧化氮的水平（P ＜ 0.05）。詳見表1。

表1 地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的尿酸、肌酐和一氧化氮水平的影響.Tab 1 Effect of Radix Rehmanniae extract on the level of serum uric acid, creatinine, nitric oxide in hyperuricemia mice. n =

表1 地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的尿酸、肌酐和一氧化氮水平的影響.Tab 1 Effect of Radix Rehmanniae extract on the level of serum uric acid, creatinine, nitric oxide in hyperuricemia mice. n =

注：與空白對(duì)照組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with blank control group,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01; compared with model group,*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01

3.2 地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的肝臟XOD及ADA活性的影響

由表2可知，與空白對(duì)照組比較，模型組高尿酸血癥小鼠肝臟XOD及ADA活性都顯著性升高（P ＜0.01），說明高尿酸血癥小鼠造模成功。與模型組相比，地黃提取物中劑量組顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟XOD活性（P ＜ 0.01）。與模型組比較，地黃提取物高劑量組均可顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟XOD及ADA的活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

表2 地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的肝臟XOD及ADA活性的影響.Tab 2 Effect of Radix Rehmanniae extract on hepatic XOD and ADA activities in hyperuricemia mice.

表2 地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的肝臟XOD及ADA活性的影響.Tab 2 Effect of Radix Rehmanniae extract on hepatic XOD and ADA activities in hyperuricemia mice.

注：與空白對(duì)照組比較，##P ＜ 0.01；與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 Note: compared with blank control group,##P ＜ 0.01; compared with model group,*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01

3.3 地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響

病理結(jié)果顯示，空白對(duì)照組：腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小管無混濁腫脹，腎小球大小正常。模型組：腎小管紊亂，腎小球出血嚴(yán)重，小球周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤。別嘌醇組：腎小管排列較為整齊，出血較少。地黃提取物低劑量組：腎小管排列趨于均勻化，炎性細(xì)胞少。地黃提取物中劑量組：腎小球排列較為均勻，炎性細(xì)胞較少，腎小管無明顯出血。地黃提取物高劑量組：腎小管排列整齊，出血較少，炎性細(xì)胞浸潤很少，腎小球結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。病理結(jié)果顯示，地黃提取物三個(gè)劑量組的病變程度明顯輕于模型組。詳見圖1。

圖1 地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響A – 空白對(duì)照組，B – 模型組，C – 別嘌醇組，D – 低劑量組，E –中劑量組，F(xiàn) – 高劑量組Fig 1 Effect of Radix Rehmanniae extract on the histomorphology of kidney in hyperuricemia miceA – blank control group, B – model group, C – allopurinol group, D –low dose group, E – middle dose group, F – high dose group

4 討論

本研究采用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀鹽為化學(xué)誘導(dǎo)劑，抑制小鼠體內(nèi)尿酸分解造成小鼠高尿酸血癥模型，方法簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，該方法建模已經(jīng)普遍用于抗高尿酸血癥和痛風(fēng)作用的藥物評(píng)價(jià)[6]及其機(jī)制研究。

高尿酸血癥導(dǎo)致機(jī)體尿酸水平升高，易引起腎功能損傷[7]，使得肌酐排泄障礙，從而引起機(jī)體肌酐水平的升高。研究報(bào)道[8-9]高尿酸血癥可升高血清ET-1水平和降低NO水平，造成血管內(nèi)皮功能障礙。XOD活性直接調(diào)控體內(nèi)尿酸水平的高低，XOD和ADA活性的升高會(huì)促進(jìn)核酸的分解代謝，導(dǎo)致尿酸生成量增加[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地黃提取物可顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸和肌酐水平，具有明顯的抗高尿酸血癥效果，提示其對(duì)腎功能有保護(hù)作用。地黃提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清中NO含量有顯著升高，說明其對(duì)血管內(nèi)皮有一定的保護(hù)作用。地黃提取物能有效降低高尿酸血癥小鼠肝臟的XOD和ADA活性，表明地黃提取物通過抑制XOD和ADA活性來減少尿酸的生成，降低血尿酸水平，從而達(dá)到改善高尿酸血癥的效果。

地黃為補(bǔ)腎陰之主藥，具有滋陰補(bǔ)腎的功效，臨床應(yīng)用作為補(bǔ)氣養(yǎng)陰藥治療氣陰兩虛型腎炎和早期腎衰竭，對(duì)降低蛋白尿和改善腎功能均有療效[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地黃提取物可明顯改善高尿酸血癥小鼠腎組織的病理變化，對(duì)高尿酸血癥所致腎臟損傷有一定的保護(hù)作用。

地黃具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，其藥理作用廣泛，對(duì)免疫、血液、內(nèi)分泌、心腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)等方面均有一定的作用。梓醇是地黃的主要有效活性成分，其為小分子化合物，水溶性好，口服易吸收[12]?，F(xiàn)代研究表明，梓醇具有抗炎[13]、止痛、神經(jīng)保護(hù)[14]、抗腫瘤、降血糖[15]等作用。我國應(yīng)用地黃的歷史悠久，并積累了豐富的用藥經(jīng)驗(yàn)，其藥用不良反應(yīng)及毒副作用甚小，可長期服用，較安全可靠。實(shí)驗(yàn)研究表明，地黃提取物具有抗高尿酸血癥作用，其藥材資源豐富。因此，對(duì)地黃提取物在抗高尿酸血癥和痛風(fēng)方面的藥用深入開發(fā)，有著極為廣闊的應(yīng)用前景。

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Effect of Radix Rehmanniae extract on hyperuricemia mice

LIU Jing, LIU Mei, YANG Bo, MA Jing, LU Yi, QIU Yan
(Department of Pharmacy, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China)

Objective:To observe the effect of Radix Rehmanniae extract on the level of serum uric acid in hyperuricemia mice and investigate the mechanism preliminarily.Methods:The intraperitoneal injection of uricase inhibition potassium oxonate was used to induce the hyperuricemia in mice. The mice were randomly divided into model group, Radix Rehmanniae extracts treatment groups (with the doses of 2, 4 and 8 g·kg-1) and the allopurinol positive control group (20 mg·kg-1). The serum levels of uric acid, creatinine, nitric oxide, and the levels of xanthine oxidase (XOD) and adenosine deaminase (ADA) in liver were observed, and the pathological changes in kidney of mice were detected.Results:After 14 days of drug intervention, compared with the model group, the Radix Rehmanniae extract middle and high dose groups reduced the levels of serum uric acid and creatinine (P ＜ 0.01), increased serum levels of nitric oxide (P ＜ 0.05, P ＜ 0.01), and significantly inhibited the liver XOD (P ＜ 0.01). It showed that Radix Rehmanniae extract high dose group significantly inhibited the ADA in hyperuricemia mice (P ＜ 0.05). The results of pathological examination showed that the pathological changes in kidney of all extracts groups were lower than that of the model group.Conclusion:The Radix Rehmanniae extract can reduce the level of serum uric acid in the model of hyperuricemia mice, and the effect is related to the inhibition of the activity of liver XOD and ADA.

Radix Rehmanniae extract; Hyperuricemia; Uric acid; Xanthine oxidase; Adenosine deaminase; Mice

R96

A

1672 – 8157(2015)06 – 0347 – 04

2015-04-12

2015-07-11）

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（09Z014）

邱彥，男，博士，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作。E-mail：qiuyan2189@163.com

劉靜，女，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。E-mail：455379546@qq.com