慢性阻塞性肺疾病患者抗菌肽LL—37表達水平的檢測及意義

宋亞茹　李榮凱　翟成凱

[摘要] 目的 檢測抗菌肽LL-37慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者血清中和誘導痰中的表達水平及其在COPD發(fā)病中的作用。 方法 選擇27例符合標準的穩(wěn)定期COPD患者（COPD穩(wěn)定組），28例符合標準的急性加重期COPD患者（COPD急性加重組）及24例健康對照者（自2014年1～8月），應用ELISA法檢測血清中和誘導痰中LL-37的含量，由定量數(shù)據(jù)分析其與FEV1%和SGRQ 分數(shù)的直線相關關系。 結果 與健康對照組相比，COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組誘導痰中LL-37的含量均明顯升高（P<0.01），三組之間血清中LL-37的含量無明顯差異（P>0.05）。COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組誘導痰中LL-37的水平與FEV1%呈負相關（P<0.05或P<0.01），而與SGRQ 分數(shù)正相關（P<0.05或P<0.01）。 結論 COPD患者誘導痰中LL-37含量升高，且其表達水平與FEV1%和SGRQ 分數(shù)有相關性，LL-37可能在COPD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

[關鍵詞] 慢性阻塞性肺疾?。籐L-37；圣喬治呼吸問卷分數(shù)；炎癥

[中圖分類號] R562.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）32-0008-03

[Abstract] Objective To examine the concentrations of LL-37 in sera and induced sputum from chronic obstructive pulmonary diseases（COPD） patients and to access the role of LL-37 in the pathogenesis of COPD. Methods The LL-37 levels were determined in sera and induced sputum from twenty-seven patients with stable COPD（SCOPD group）， twenty-eight patients with acute exacerbation of COPD（AECOPD group）and twenty-four healthy controls （from Jan to Aug 2014）by ELISA， and then the linear correlations with FEV1% and SGRQ scores were analyzed using quantitative data. Results Compared with healthy control group， the levels of LL-37 in induced sputum were markedly higher in SCOPD group and AECOPD group（P<0.01）. However， the levels of LL-37 in sera were no difference among these three groups（P>0.05）. Furthermore， the LL-37 levels in induced sputum negatively correlated with FEV1% in both SCOPD group（P<0.05）and AECOPD group（P<0.01）. On the contrary，the LL-37 levels in induced sputum positively correlated with SGRQ scores in both SCOPD group（P<0.05） and AECOPD group（P<0.01）. Conclusion The expression levles of LL-37 are increased in induced sputum from COPD patients compared with healthy controls，and correlated with FEV1% and SGRQ scores in COPD patients， suggesting that LL-37 may play an important role in the pathogenesis of COPD.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary diseases； LL-37； SGRQ scores； Inflammation

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種持續(xù)存在的以不完全可逆的氣流受限為特征的慢性呼吸道疾病，近年來的研究表明，氣道局部浸潤的固有免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞活化后釋放的炎癥介質(zhì)和蛋白酶成分在COPD的致病過程中扮演重要角色[1，2]，然而精確的發(fā)病機制尚未完全闡明。內(nèi)源性抗菌肽是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在人類已經(jīng)鑒定出十多種抗菌肽，而防御素家族和Cathelicidins家族是機體最重要的內(nèi)源性抗菌肽。到目前為止，LL-37是Cathelicidins家族的唯一成員[3]。LL-37具有光譜抗菌活性，參與抵抗和殺傷革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌和病毒等，還可以中和革蘭陰性菌細胞壁的脂多糖內(nèi)毒素[4-5]。然而，LL-37在人類COPD患者的表達及其重要性尚不清楚。

1 對象與方法

1.1 研究對象

COPD組：病例收集自2014年1～8月在新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院呼吸科住院的COPD患者55例，其中男42例，女13例，病例入選標準均符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會制定的COPD診斷標準[6]。病例組又分為穩(wěn)定期27例和急性加重期28例。健康對照組：于新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院體檢中心選擇無心肺疾病，且近期無呼吸道感染史，肺功能正常的健康志愿者24例，其中男17例，女7例。所有入選者均知情并簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

肺功能測定：所有受試對象的肺功能均在同一肺功能檢測醫(yī)師指導下使用德國耶格肺功能儀測定，肺功能指標包括第一秒用力呼氣容積（FEV1）占預計百分比（FEV1% pred）和第一秒用力呼氣容積占用力肺活量（FVC）的百分比（FEV1/FVC（%））等。受試對象的健康狀況使用St.George's呼吸調(diào)查表（St.George's Respiratory Questionnaire，SGRQ）評估[7，8]，SGRQ的評估分數(shù)范圍是0～100分，分數(shù)越低表示健康狀況越好。

1.3 檢測指標

1.3.1 血液標本和誘導痰標本收集 所有受試對象均于清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，凝固離心后小心吸取上清液即血清凍存于-80℃冰箱。受試對象先吸入沙丁胺醇200 μg，20 min之后通過超聲噴霧器吸入3%高滲生理鹽水，隨即收集誘導出的痰液并稱重，粘液稀釋離心后吸取上清液凍存于-80℃冰箱，待檢測。

1.3.2 LL-37的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中和誘導痰中LL-37的含量，嚴格按照試劑盒（上海佳和生物科技有限公司）說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學處理

計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間均數(shù)差異采用雙側非配對t檢驗，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Spearman 秩相關分析。所有分析均應用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計學軟件進行，所有統(tǒng)計結論采用0.01與0.05兩概率界值。

2 結果

2.1 三組間臨床資料分析

三組研究對象的臨床資料特征見表1，與健康對照組相比，COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組均存在不同程度的氣流受限，肺功能檢測相關指標FEV1%pred和FEV1/FVC差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。另外，COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組的吸煙指數(shù)明顯高于健康對照組（P<0.05或P<0.01），SGRQ亦明顯高于健康對照組（P<0.01）。而各組在年齡構成方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 血清中和誘導痰中LL-37的表達變化

健康對照組與COPD穩(wěn)定組血清中LL-37的水平無明顯變化[（291.8±15.52）pg/mL vs （282.9±17.36）pg/mL，P>0.05]，與COPD急性加重組血清中LL-37的水平亦無明顯變化[（291.8±15.52）pg/mL vs （274.6±17.44）pg/mL，P>0.05]，見圖1。與健康對照組相比，COPD穩(wěn)定組誘導痰中LL-37水平明顯升高[（2.7±0.25）ng/mL vs （6.3±0.42）ng/mL，P<0.01]，COPD急性加重組誘導痰中LL-37的水平也顯著升高[（2.7±0.25）ng/mL vs （9.5±0.45）ng/mL，P<0.001]。急性加重組誘導痰中LL-37水平高于穩(wěn)定組，差異有統(tǒng)計學意義[（9.5±0.45）ng/mL vs （6.3±0.42）ng/mL，P<0.01]，見圖2。

2.3 LL-37與FEV1%和SGRQ的相關性分析

相關性分析結果顯示：COPD穩(wěn)定組誘導痰中LL-37水平與肺功能指標FEV1%負相關，相關系數(shù)r=-0.432（P<0.05）；急性加重組誘導痰中LL-37的水平亦與肺功能指標FEV1%負相關，相關系數(shù)r=-0.562（P<0.01），見圖3。此外，COPD穩(wěn)定組和急性加重組誘導痰中LL-37的水平與SGRQ均呈正相關關系，相關系數(shù)分別為r=0.459（P<0.05）和r=0.669（P<0.001），見圖3。

3 討論

內(nèi)源性抗菌肽是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗感染免疫過程中發(fā)揮重要作用。LL-37首次從骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)，是人類Cathelicidins家族的唯一成員[9]，LL-37分布廣泛，主要由局部固有免疫細胞如巨噬細胞、中性粒細胞和局部上皮細胞分泌釋放[2，3]。然而LL-37在人類COPD患者中的表達及重要性尚未研究。在本項研究中，為探討LL-37在COPD致病過程中的可能作用，我們首先檢測LL-37在COPD患者血清中和誘導痰中的表達水平，接著分析LL-37的表達水平與肺功能相關指標的相關性。

COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組誘導痰中LL-37的水平與健康對照組相比顯著升高，并且COPD急性加重組高于COPD穩(wěn)定組，造成這種差異的原因可能是氣道炎癥應答的不同狀態(tài)所致。一般情況下，急性加重期同時伴有流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌感染，相對于穩(wěn)定期，這種感染會進一步誘發(fā)局部炎癥應答，LL-37水平分泌增加可能做為一種反饋機制抑制此種炎癥應答。免疫組化結果顯示LL-37主要表達于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、肺部浸潤的中性粒細胞和巨噬細胞等炎細胞[10]，推測這些細胞是導致LL-37水平升高的重要來源。COPD患者誘導痰中LL-37的異常升高不僅僅是局部免疫細胞浸潤數(shù)量的增加導致，而是于炎癥環(huán)境中多種細胞共同參與交互作用調(diào)節(jié)的結果。我們進一步分析了LL-37與肺功能指標FEV1%和SGRQ的相關性，重要的是，發(fā)現(xiàn)LL-37的水平與FEV1%存在明顯的負相關，提示LL-37的表達水平可以在一定程度上預測肺功能的狀況。此外，LL-37的水平與SGRQ存在明顯的正相關，我們建議采用LL-37和SGRQ雙重指標可能更能反映COPD的疾病嚴重程度。

總之，這些研究結果提示LL-37可能在COPD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，LL-37發(fā)揮作用的機制以及能否用于臨床診斷和治療COPD有待于進一步研究。

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（收稿日期：2015-08-31）