克雷伯氏桿菌代謝靈活性分析

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

通量平衡分析被廣泛應(yīng)用于分析代謝網(wǎng)絡(luò)的功能［1］?；诜€(wěn)態(tài)的假設(shè)，該方法能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)速率并給出一組滿足條件的通量分布。但是最大生長(zhǎng)速率下的通量分布不止一組，要獲得全部的解空間可使用基元模式分析［2］，該方法所得的基元模式個(gè)數(shù)隨代謝網(wǎng)絡(luò)中反應(yīng)個(gè)數(shù)的增加呈指數(shù)增加，因此，基因組尺度的代謝網(wǎng)絡(luò)通過枚舉基元模式的方法獲得所有通量分布也是不可行的。通量可變性分析可以對(duì)基因組尺度的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行計(jì)算得到目標(biāo)函數(shù)值下每個(gè)反應(yīng)通量值的范圍（即通量解空間），該通量解空間的體積可用來衡量微生物的代謝靈活性。

微生物為了生存會(huì)利用自身的代謝能力適應(yīng)不斷改變的外界環(huán)境，改變內(nèi)部代謝通量分布。該適應(yīng)性行為具有多樣性但必須滿足化學(xué)計(jì)量學(xué)約束，而當(dāng)菌體的適應(yīng)性行為只有化學(xué)計(jì)量學(xué)約束，而沒有動(dòng)力學(xué)約束和代謝調(diào)控約束時(shí)，可以利用通量可變性分析對(duì)其解空間進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而衡量菌體的代謝靈活性。西班牙學(xué)者San等［3］將菌體代謝靈活性改變的原因分為3部分：內(nèi)部反應(yīng)的可變性、交換反應(yīng)的可變性和生長(zhǎng)速率的可變性，并利用基因組尺度的大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)iJO1366，以葡萄糖為底物對(duì)這3 個(gè)因素的重要性進(jìn)行了分析。

克雷伯氏桿菌以生物柴油的副產(chǎn)物甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)重要化學(xué)原料1，3－丙二醇的生物方法［4］近年來已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化。許多學(xué)者對(duì)如何提高1，3－丙二醇產(chǎn)率進(jìn)行了多方面研究，并取得了相應(yīng)的成果。曾宏等［5］對(duì)甘油脫氫酶的生產(chǎn)工藝進(jìn)行模擬并進(jìn)行經(jīng)濟(jì)分析；朱曉麗等［6］使用大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體與LiCl進(jìn)行復(fù)合誘變，結(jié)合FeCl3和產(chǎn)物耐受的篩選方法獲得1，3－丙二醇高產(chǎn)突變菌株；陳琳等［7］以木糖作為發(fā)酵過程中的輔助底物與甘油共發(fā)酵生產(chǎn)1，3－丙二醇，1，3－丙二醇產(chǎn)率和甘油轉(zhuǎn)化率均得到提高；徐衛(wèi)濤等［8］通過控制發(fā)酵過程中的pH 值提高1，3－丙二醇的產(chǎn)率。以上均是通過改變外部條件來提高1，3－丙二醇產(chǎn)率。目前，還沒有學(xué)者對(duì)克雷伯氏桿菌代謝甘油發(fā)酵生長(zhǎng)應(yīng)對(duì)外界環(huán)境改變的代謝靈活性進(jìn)行理論分析。鑒于此，作者使用代謝流分析軟件COBRA Toolbox，對(duì)克雷伯氏桿菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通量平衡分析與通量可變性分析，分別得到內(nèi)部反應(yīng)的可變性、交換反應(yīng)的可變性和生長(zhǎng)速率的可變性等3個(gè)因素對(duì)菌體代謝靈活性的影響程度，通過進(jìn)一步研究生長(zhǎng)速率對(duì)菌體代謝靈活性的影響，找到提高代謝靈活性的兩個(gè)必要條件，從而增強(qiáng)菌體應(yīng)對(duì)外界環(huán)境改變的能力，指導(dǎo)菌體實(shí)際生長(zhǎng)。

1 模型與方法

1.1 克雷伯氏桿菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)

本實(shí)驗(yàn)使用Liao等［9］重構(gòu)的克雷伯氏桿菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)iYL1228，該網(wǎng)絡(luò)包括1 229個(gè)基因、1 658個(gè)代謝物、2 262個(gè)生物反應(yīng)，并按照功能將反應(yīng)劃分為62個(gè)子系統(tǒng)。在構(gòu)建該基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)時(shí)，學(xué)者們對(duì)84%的底物進(jìn)行生長(zhǎng)模擬，發(fā)現(xiàn)其模擬數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤率低于31%，大部分的錯(cuò)誤率集中在0.4%～26.3%之間，顯示出良好的一致性，因此可以用該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模擬計(jì)算?？死撞蠗U菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)iYL1228的參考條件見表1。

表1 克雷伯氏桿菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)iYL1228的參考條件Tab .1 Reference conditions of genome－scale metabolic network iYL1228for Klebsiella pneumonlae

1.2 算法

本實(shí)驗(yàn)使用的代謝流分析軟件COBRA Toolbox（Constraint－based Reconstruction and Analysis）［10－11］是運(yùn)行在MATLAB環(huán)境下的工具包，該工具包結(jié)合GUN 線性規(guī)劃工具（glpk）可對(duì)基因組尺度的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通量平衡分析與通量可變性分析。

1.2.1 通量平衡分析

通量平衡分析以生長(zhǎng)速率最大為目標(biāo)函數(shù)，利用線性規(guī)劃找到穩(wěn)態(tài)條件下的通量分布。該線性規(guī)劃問題用公式描述為：

式中：A為化學(xué)計(jì)量矩陣，若一個(gè)系統(tǒng)有m種代謝物，r個(gè)反應(yīng)，則矩陣就有m行r列；反應(yīng)通量值v作為列向量；穩(wěn)態(tài)條件下，b為零向量；代表反應(yīng)i在參考條件下計(jì)算出的通量最大值與最小值。

1.2.2 通量可變性分析

通量可變性分析可將可行的解空間量化，在與通量平衡分析相同的約束條件下，通量可變性分析可以將每個(gè)反應(yīng)的最大值與最小值計(jì)算出來。該線性規(guī)劃問題用公式描述為：

其中，相對(duì)于參考條件的通量可變性用公式表達(dá)為：

有兩類反應(yīng)對(duì)通量可變性沒有影響，計(jì)算Δ時(shí)不需要計(jì)算，這兩類反應(yīng)是：內(nèi)部循環(huán)反應(yīng)、通量最大值與最小值相同的反應(yīng)。其中，后者又分為兩類：反應(yīng)通量值為零的反應(yīng)和不為零的反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 通量可變性的組成及計(jì)算

通量可變性來源于3部分：內(nèi)部反應(yīng)的通量可變性（Δint）、交換反應(yīng)的通量可變性（Δext）和生長(zhǎng)速率的通量可變性（Δgro）。為計(jì)算這3部分?jǐn)?shù)值，分別用vint、vext與vgro表示內(nèi)部反應(yīng)的通量值、交換反應(yīng)的通量值與生長(zhǎng)速率的通量值。給定條件下，分別表示最優(yōu)生長(zhǎng)速率、最優(yōu)生長(zhǎng)條件下的交換反應(yīng)速率。Δint就是在約束條件下的值（圖1中a 曲線）。僅固定，那么所計(jì)算的Δ（Δint＋ext）就是內(nèi)部反應(yīng)固有變化和外部反應(yīng)變化之和（圖1中b曲線）。Δint＋ext減去Δint就是外部反應(yīng)的變化（Δext）。將約束條件去除，所得到的Δtot就是3個(gè)原因?qū)е碌耐靠傋兓?，此時(shí)Δtot＝Δgro＋Δint＋Δext（圖1中c曲線）。

圖1 通量可變性的組成Fig.1 Composition of flux variability

2.2 底物吸收速率對(duì)通量可變性的影響

外部環(huán)境的改變會(huì)影響通量可變性，進(jìn)而影響菌體的代謝靈活性。以下就底物（甘油、氧氣和氨）的吸收速率對(duì)通量可變性的影響進(jìn)行研究。

2.2.1 甘油吸收速率對(duì)通量可變性的影響

有氧條件與無氧條件下，甘油吸收速率對(duì)通量可變性的影響如圖2所示。

圖2 甘油吸收速率對(duì)通量可變性的影響Fig.2 Effect of glycerol uptake rate on flux variability

由圖2可看出：有氧條件下，甘油吸收速率為0.46 mmol·gDW－1·h－1時(shí)能夠滿足ATP所需的最小能量；無氧條件下，甘油吸收速率為5.44 mmol·gDW－1·h－1時(shí)才能滿足ATP所需的最小能量。

為了考察超出生理范圍甘油吸收速率（10.6 mmol·gDW－1·h－1）的代謝靈活性與生理范圍內(nèi)的規(guī)律是否一致，將甘油吸收速率增大到16 mmol·gDW－1·h－1，結(jié)果顯示，在甘油吸收速率生理范圍外，Δint與Δext對(duì)代謝靈活性的影響幾乎可以忽略不計(jì)，Δgro是影響通量可變性的唯一重要因素。

2.2.2 氧氣吸收速率對(duì)通量可變性的影響（圖3a）

圖3 氧氣吸收速率（a）和氨吸收速率（b）對(duì)通量可變性的影響Fig.3 Effect of oxygen uptake rate（a）and ammonia uptake rete（b）on flux variability

由圖3a可看出，細(xì)胞生長(zhǎng)所帶來的可變性對(duì)代謝靈活性的影響最大，其它2個(gè)因素所帶來的影響可以忽略不計(jì)。

2.2.3 氨吸收速率對(duì)通量可變性的影響（圖3b）

由圖3b可看出：當(dāng)氨吸收速率大于5.6mmol·gDW－1·h－1時(shí)，Δgro依然是影響通量可變性的最主要因素；當(dāng)氨吸收速率小于5.6 mmol·gDW－1·h－1時(shí)，Δint與Δext對(duì)代謝靈活性也有重要的影響，其中Δint影響更大。

2.3 碳氮調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)通量可變性的影響

在大腸桿菌中，葡萄糖的吸收速率隨氮的浮動(dòng)而被調(diào)控［12］，進(jìn)而影響通量可變性。為此，添加了碳氮調(diào)節(jié)機(jī)制，研究其對(duì)克雷伯氏桿菌通量可變性的影響。

圖4 碳氮調(diào)節(jié)機(jī)制下，氨吸收速率對(duì)通量可變性的影響Fig.4 Effect of ammonia uptake rate on flux variability under coordination of carbon and nitrogen utilization

由圖4可知，碳氮調(diào)節(jié)機(jī)制下，Δgro對(duì)通量可變性的影響很大，Δint與Δext幾乎為零，對(duì)通量可變性的影響可以忽略。因此，碳氮調(diào)節(jié)機(jī)制下，生長(zhǎng)速率的變化仍然是影響通量可變性的唯一重要因素。

以上結(jié)果顯示，生長(zhǎng)速率的變化是引起菌體代謝靈活性改變的主要原因。

2.4 生長(zhǎng)速率對(duì)通量可變性的影響

由圖2可知，固定甘油吸收速率就能固定Δ和最大生長(zhǎng)速率。因此固定菌體的生長(zhǎng)速率，就可以得到Δ和的關(guān)系曲線（圖5中▼曲線），這里的是甘油吸收速率為10.6mmol·gDW－1·h－1時(shí)的最大生長(zhǎng)速率，vgro為較小甘油吸收速率下的生長(zhǎng)速率。甘油吸收速率能夠約束生物體的最大生長(zhǎng)速率，因此能夠影響Δ。另一種約束生長(zhǎng)速率的方法就是固定其通量值的上限和下限，而不對(duì)外部通量值加以限制。本實(shí)驗(yàn)在限制生長(zhǎng)速率的范圍而沒有改變其可以得到的最大生長(zhǎng)速率的情況下，考察生長(zhǎng)速率對(duì)通量可變性的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 生長(zhǎng)速率對(duì)通量可變性的影響Fig.5 Effect of growth rate on flux variability

由圖5可看出：方形（■）中的vgro代表0），Δ值始終保持在1.0附近而沒有變化，說明通量可變性隨上限值確定的生長(zhǎng)速率值變化不敏感；圓圈（○）中的vgro代表，即參考條件下獲得的最大生長(zhǎng)速率）；實(shí)心圓（●）中生長(zhǎng)速率的上下限值相同），這兩條曲線顯示出幾乎相同的變化趨勢(shì)，Δ值均隨著值的增大而減小。

由圖5還可看出：要使菌體獲得較大的代謝靈活性，首先要提供較大的甘油吸收速率，這樣菌體才會(huì)有大的生長(zhǎng)速率；另外要將生長(zhǎng)速率調(diào)控至比理想值小的值，即菌體在次優(yōu)模式下生長(zhǎng)。這樣克雷伯氏桿菌就可以具備較大的代謝靈活性來應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的改變。

3 結(jié)論

使用COBRA Toolbox軟件對(duì)基因組尺度的克雷伯氏桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了通量平衡分析和通量可變性分析，將外界環(huán)境的改變對(duì)菌體代謝靈活性的影響量化，分別計(jì)算出通量可變性3個(gè)因素?cái)?shù)值。結(jié)果表明，生長(zhǎng)速率的可變性是影響其代謝靈活性的唯一主要因素；并進(jìn)一步分析了生長(zhǎng)速率如何影響代謝靈活性，得到兩個(gè)必要條件：（1）提供較大的甘油吸收速率供菌體生長(zhǎng)；（2）調(diào)控菌體至次優(yōu)模式下生長(zhǎng)。這兩點(diǎn)可使菌體獲得較大的代謝靈活性以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的改變。

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