甩片改良抗酸法與FQ-PCR技術(shù)在腦脊液抗酸菌檢查中的應(yīng)用分析

呂翠環(huán)，李玉靜，孫志平，李 卓，呂 莎，鄭立恒

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050041;2.河北省胸科醫(yī)院骨科，河北石家莊050041; 3.河北省胸科醫(yī)院呼吸科，河北石家莊050041)

甩片改良抗酸法與FQ-PCR技術(shù)在腦脊液抗酸菌檢查中的應(yīng)用分析

呂翠環(huán)1，李玉靜1，孫志平1，李 卓2*，呂 莎3，鄭立恒1

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050041;2.河北省胸科醫(yī)院骨科，河北石家莊050041; 3.河北省胸科醫(yī)院呼吸科，河北石家莊050041)

目的評(píng)價(jià)腦脊液改良抗酸染色法與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)法診斷結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)的意義。方法 TBM患者81例，采集腦脊液檢測標(biāo)本，分別采用離心甩片改良抗酸染色法、實(shí)時(shí)FQ-PCR法檢測抗酸桿菌。結(jié)果81例改良抗酸染色法陽性率66.7%(54/81)高于FQ-PCR方法陽性率50.6%(41/81)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論在診斷TBM方面，改良抗酸染色方法顯著優(yōu)于FQ-PCR方法。

結(jié)核，腦膜;染色與標(biāo)記;實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常見的肺外結(jié)核病之一，致殘率和致死率高，其預(yù)后與早期診斷和早期治療有密切關(guān)系，但是因其臨床表現(xiàn)不典型，確診十分困難。目前對(duì)結(jié)核的診斷手段較多，但有的特異度低、有的準(zhǔn)確度低，各有其局限性。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) (fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)反應(yīng)靈敏、特異度高、高效快速，這些優(yōu)勢是涂片法及培養(yǎng)法難以達(dá)到的［1］。改良抗酸染色法是在普通涂片抗酸染色基礎(chǔ)上，對(duì)腦脊液涂片進(jìn)行特殊處理，以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的抗酸桿菌，提高陽性率。本研究回顧性分析河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科81例TBM腦脊液標(biāo)本資料，并進(jìn)行FQ-PCR檢測與改良抗酸染色檢測的比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013—2014年河北省胸科醫(yī)院確診為TBM的患者81例，男性47例，女性34例，年齡14～68歲，平均(32.1±12.3)歲。收集所有患者的腦脊液進(jìn)行改良抗酸染色及FQ-PCR檢測，送檢時(shí)間為發(fā)病后3～37 d。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有患者經(jīng)過臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷、影像學(xué)診斷、臨床治療評(píng)價(jià)等，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著的《臨床診療指南結(jié)核病學(xué)分冊(cè)》標(biāo)準(zhǔn)確診［2］。

1.3 方法

1.3.1 改良抗酸染色［3］標(biāo)本處理，收取腦脊液1.0～1.5 mL，置于Thermo Scientific Cytospin 4型細(xì)胞離心涂片機(jī)中制備涂片。用4%多聚甲醛固定15 min，0.3% TritonX-100浸泡30 min?？顾崛旧?①石炭酸復(fù)紅溶液染色10 min后，流水輕輕沖洗;②加3%鹽酸酒精溶液脫色1～2 min至近無色，流水輕輕沖洗;③加亞甲基藍(lán)溶液染色30 s，流水輕輕沖洗，待干，鏡檢;④每次染色，同時(shí)做陰、陽性質(zhì)控片，質(zhì)控片染色結(jié)果正確，方可進(jìn)行臨床標(biāo)本閱片;⑤由有3年以上工作經(jīng)驗(yàn)人員在光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察。

1.3.2 FQ-PCR檢測 收取腦脊液1 mL進(jìn)行腦脊液結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸檢測，儀器設(shè)備為達(dá)安基因有限公司生產(chǎn)的7600型實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng)，試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光試劑盒。嚴(yán)格按照試劑說明書操作，每次操作均加入質(zhì)控品。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

改良抗酸染色法陽性率66.7%(54/81)高于FQ-PCR法50.6%(41/81)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 2種方法檢測結(jié)果比較Table1 Comparison of the results of two methods (例數(shù))

3 討 論

結(jié)核病是全球性的公共衛(wèi)生問題［4］，TBM是肺外結(jié)核中最嚴(yán)重的結(jié)核病，由結(jié)核桿菌引起，早期診斷困難，病殘率和病死率高，是結(jié)核病死亡的主要原因［5］。臨床對(duì)TBM的診斷主要依據(jù)腦脊液、臨床表現(xiàn)以及腦影像學(xué)［6］來判斷患者的病情程度。腦脊液是能夠直接反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理變化的標(biāo)本，是實(shí)驗(yàn)診斷TBM的理想標(biāo)本。如果在腦脊液中檢測出結(jié)核桿菌及其特異度標(biāo)記物等，則能夠?yàn)榕R床診斷TBM提供依據(jù)。目前對(duì)結(jié)核桿菌的檢測方法有許多，培養(yǎng)法是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其需要5～6周的時(shí)間，直接涂片顯微鏡檢查是目前所有方法中比較快速的，但其靈敏度和特異度低［7］，這些方法各有其局限性。

本研究結(jié)果顯示，甩片法改良抗酸染色陽性率為66.7%，高于于慶杰等［8］的報(bào)道研究。甩片改良抗酸法應(yīng)用離心甩片機(jī)將腦脊液中有形成分通過小孔聚集在載玻片上，形成直徑約0.5 cm薄膜，菌量集中，易于找到，且利用多聚甲醛將細(xì)胞等物質(zhì)進(jìn)行充分固定，因結(jié)核桿菌是一種緩慢的細(xì)胞內(nèi)寄生菌［9］，利用TritonX-100對(duì)細(xì)胞膜的滲透性，使抗酸染色試劑滲入細(xì)胞內(nèi)，從而使細(xì)胞內(nèi)的抗酸菌易于著色［10］。

FQ-PCR法作為一種較理想的檢測TBM的方法，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中得到廣泛的應(yīng)用，理論上，只要樣本中有一個(gè)病原體存在，就可以檢測到。一般實(shí)驗(yàn)室能檢出10～100基因拷貝，而目前其他病原體抗原檢測方法一般需要105～107個(gè)病原體才可檢測到。FQ-PCR法已有研究資料表明［11-12］，病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。FQ-PCR方法可進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測，特異度更強(qiáng)，操作簡單快速。有報(bào)道［13］基因探針方法檢測TBM結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸敏感度33%～83%，特異度100%。Amin等［14］報(bào)道用FQ-PCR法檢測腦脊液結(jié)核菌陽性率為42.1%。而FQ-PCR法檢測腦脊液結(jié)核桿菌具有更高的敏感度與特異度［15-16］。本研究結(jié)果顯示，81例TBM標(biāo)本中FQ-PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸陽性41例(50.6%)，與報(bào)道基本相符。

綜合分析甩片改良抗酸法操作相對(duì)簡單，無需昂貴的設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室條件要求相對(duì)較低，成本相對(duì)低廉，而FQ-PCR法則各個(gè)方面要求條件嚴(yán)格，成本相對(duì)增加，加重患者負(fù)擔(dān)。本研究結(jié)果顯示，對(duì)于TBM的實(shí)驗(yàn)室診斷，腦脊液標(biāo)本應(yīng)用甩片法改良抗酸染色檢測結(jié)核桿菌陽性率大大提高，而檢測成本并未相應(yīng)提高，是單項(xiàng)指標(biāo)中較理想的項(xiàng)目，而FQPCR法檢測結(jié)核菌如果條件允許也不失為一種好的檢測方法。

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(本文編輯:趙麗潔)

Analysis of acid fast bacilli in cerebrospinal fluid with modified acid-fast method and FQ-PCR technique

LV Cui-huan1，LI Yu-jing1，SUN Zhi-ping1，LI Zhuo2*，LV Sha3，ZHENG Li-heng1
( 1． Department of Clinical Laboratory，the Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 2． Department of Orthopedics，the Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 3． Department of Respiratory Medicine，the Chest Hospital of Hebei Province， Shijiazhuang 050041，China)

Objective To evaluate united test significance in the diagnosis of tuberculous meningitis(TBM) with modified acid-fast staining method of cerebrospinal fluid and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).MethodsCerebrospinal fluid samples from 81 patients with TBM were detected for Mycobacterium tuberculosis respectively with centrifugal modified acid-fast staining method and real-time FQ-PCR.Results The positive rate of modified acidfast staining 66.7%(54/81)was significantly higher than that of FQ-PCR 50.6%(41/81)，there was significant difference between the two methods(P＜0.05).ConclusionModified acid-fast staining method is significantly better than FQ-PCR in the diagnosis of TBM.

tuberculosis，meningeal;staining and labeling;real-time polymerase chain reaction

R529.3

A

1007-3205(2015)02-0170-03

2014-10-15;

2014-12-09

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(13277794D);河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目(132777269)

呂翠環(huán)(1966-)，女，河北石家莊人，河北省胸科醫(yī)院主任技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事臨床檢驗(yàn)學(xué)研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.018