結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核中的診斷價(jià)值

賈晨光，姚黎明*，李秀武，劉豐勝，章志華，張金文

(1.河北省胸科醫(yī)院骨科，河北石家莊050041;2.河北省胸科醫(yī)院病理科，河北石家莊050041; 3.河北省胸科醫(yī)院科教處，河北石家莊050041)

結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核中的診斷價(jià)值

賈晨光1，姚黎明1*，李秀武2，劉豐勝1，章志華3，張金文3

(1.河北省胸科醫(yī)院骨科，河北石家莊050041;2.河北省胸科醫(yī)院病理科，河北石家莊050041; 3.河北省胸科醫(yī)院科教處，河北石家莊050041)

目的評(píng)價(jià)結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)(tuberculous infection of T cells spot test，T-SPOT.TB)在疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核病中的診斷價(jià)值。方法 選取80例確診為骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者和44例排除結(jié)核患者。分別進(jìn)行抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及T-SPOT.TB，比較并分析檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果T-SPOT.TB的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度分別為82.5%、75.0%、79.8%。T-SPOT.TB的陽(yáng)性檢出率顯著高于抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)(P＜0.05)，而在不同疾病部位(脊柱、四肢關(guān)節(jié))及不同病程分組間陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論T-SPOT.TB可以作為骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的重要輔助診斷方法。

結(jié)核，骨關(guān)節(jié);結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè);診斷

目前結(jié)核病仍是嚴(yán)重危及人類健康的主要傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球每年新發(fā)結(jié)核病患者約890萬(wàn)。據(jù)第5次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)已有1/3以上的人口感染了結(jié)核菌，15歲及以上人群活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率為459/10萬(wàn)，涂陽(yáng)肺結(jié)核患病率為66/10萬(wàn)［1］。骨關(guān)節(jié)結(jié)核病占結(jié)核患者總數(shù)的1%～5%。控制結(jié)核病的關(guān)鍵問(wèn)題是快速診斷并及時(shí)治療。結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，也是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)［2］。目前結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)(tuberculous infection of T cells spot test，TSPOT.TB)已經(jīng)列入歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家的結(jié)核病診療指南，以協(xié)助診斷結(jié)核感染的存在［3］。該檢測(cè)是利用結(jié)核菌感染者外周血單核細(xì)胞中存在結(jié)核特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核桿菌特異抗原刺激后分泌γ干擾素而設(shè)計(jì)的T細(xì)胞免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，具有較高的靈敏度和特異度。本研究旨在探討T-SPOT.TB在診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核病中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月—2014年5月河北省胸科醫(yī)院骨科收治的懷疑骨關(guān)節(jié)結(jié)核的患者124例，男性66例，女性58例，年齡14～83歲，平均(47.9±23.5)歲。根據(jù)病史、臨床特點(diǎn)、影像學(xué)表現(xiàn)、組織病理學(xué)和病原學(xué)檢查結(jié)果以及抗結(jié)核治療效果進(jìn)行診斷，分為確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者80例，排除結(jié)核患者44例。見表1。

表1 124例懷疑骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者臨床資料Table 1 Clinical characteristics of 124 patients with suspected osteoarticular tuberculosis (例數(shù)，%)

1.2 方法 所有患者進(jìn)行T-SPOT.TB，與臨床診斷結(jié)果進(jìn)行比較。另外，對(duì)確診骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者組分別進(jìn)行涂片抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，比較陽(yáng)性檢出率。根據(jù)病變部位(脊柱/四肢關(guān)節(jié))及病程(即住院前出現(xiàn)癥狀的時(shí)間:≤6個(gè)月，＞6～12個(gè)月，＞12～24個(gè)月，＞24～48個(gè)月)分別評(píng)估T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率。

1.2.1 T-SPOT.TB 受試者用肝素鋰抗凝采血管抽取5 mL靜脈血，即刻輕柔顛倒混勻3～5次，使抗凝劑充分溶解。3 h內(nèi)將采集的全血分裝到3種不同的培養(yǎng)管中，“T”為添加結(jié)核特異性抗原ESAT-6、CFP-10的測(cè)試培養(yǎng)管，“N”為本底對(duì)照培養(yǎng)管，“P”為添加非特異刺激原植物血凝素的陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管，每種培養(yǎng)管分裝1 mL，分裝前需要顛倒混勻3次以上，分裝后輕柔顛倒培養(yǎng)管5次并立刻置于37℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)(22±2)h后取出，離心收集上清液，然后用雙抗體夾心法定量檢測(cè)上清中γ干擾素的含量，最后計(jì)算刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中特異性升高的γ干擾素量判定是否為結(jié)核桿菌感染陽(yáng)性。

1.2.2 涂片抗酸染色 所有診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核病患者的標(biāo)本處理均依據(jù)“中國(guó)防癆協(xié)會(huì)指導(dǎo)方針”進(jìn)行［4］。固體組織研碎后采用4%NaOH處理10 min，其他液體標(biāo)本直接采用4%NaOH處理10 min。6 000 r/min離心15 min，棄上清，用少量生理鹽水混勻沉淀物，均勻涂抹于載玻片上，自然干燥后，行抗酸染色鏡檢。

1.2.3 結(jié)核菌培養(yǎng) 余下的懸浮液置于培養(yǎng)基上進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，接種后3、7 d觀察，此后每周觀察1次，有菌落生長(zhǎng)后用抗酸染色驗(yàn)證，若同時(shí)為陽(yáng)性記錄為陽(yáng)性，否則為陰性，至第8周仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)記錄為陰性。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 活組織檢查或手術(shù)標(biāo)本采用熒光定量試劑盒檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。標(biāo)本經(jīng)去污和離心后，得到50μL DNA提取液，混勻后沸水煮10 min，4℃放置6～8 h。10 000 r/min離心5 min，取上清用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SSPS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，分別采用χ2檢驗(yàn)和四格表的診斷性試驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 T-SPOT.TB的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度 TSPOT.TB的敏感度為82.5%，特異度為75.0%，準(zhǔn)確度為79.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為85.7%，陰性預(yù)測(cè)值為70.2%。見表2。

表2 T-SPOT.TB的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度Table 2 Diagnostic performance of T-SPOT.TB assay in 124 osteoarticular tuberculosis patients (n=124，例數(shù)，%)

2.2 不同疾病部位和病程T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率比較 80例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中包括脊柱結(jié)核55例和關(guān)節(jié)結(jié)核25例;病程≤6個(gè)月30例，＞6～12個(gè)月25例，＞12～24個(gè)月15例，＞24～48個(gè)月10例。不同疾病部位和病程T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 不同疾病部位和病程T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率比較Table 3 The positive rate of T-SPOT.TB for different locations and courses of osteoarticular tuberculosis (例數(shù)，%)

2.3 不同檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率比較 T-SPOT.TB的陽(yáng)性檢出率顯著高于涂片抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 不同檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率比較Table 4 The positive rates of four test methods in osteoarticular tuberculosis (例數(shù)，%)

3 討 論

骨關(guān)節(jié)結(jié)核病是臨床常見且難以進(jìn)行病原學(xué)診斷的疾病。主要原因之一就是骨關(guān)節(jié)結(jié)核病早期病程隱匿，典型的臨床癥狀不明顯，易被患者和醫(yī)生所忽視，且結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，敏感性低，以致臨床上經(jīng)常誤診和漏診，因此診斷早期骨關(guān)節(jié)結(jié)核及非典型癥狀疑似結(jié)核感染尤為困難。以往診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核病一般根據(jù)典型的臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)、活組織檢查或手術(shù)標(biāo)本病理檢查以及結(jié)核菌培養(yǎng)等綜合方法。傳統(tǒng)方式仍有各自的缺點(diǎn)和不足:結(jié)核分枝桿菌涂片抗酸染色的敏感性很低，本研究中抗酸染色陽(yáng)性檢出率僅為11.2%;結(jié)核菌培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)(需6～8周)，本研究中其陽(yáng)性檢出率為40.0%，容易延誤病情的診治;近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核病領(lǐng)域中應(yīng)用愈加廣泛，但PCR技術(shù)的陽(yáng)性檢出率在不同研究中差異較大［5］，究其原因可能有活組織檢查或手術(shù)取材部位菌群分布不均，宿主蛋白質(zhì)、血液及真核細(xì)胞DNA環(huán)境變異等因素。此外，以上組織標(biāo)本均通過(guò)外科活組織檢查或手術(shù)途徑獲得，患者均需承受有創(chuàng)性操作帶來(lái)的痛苦與風(fēng)險(xiǎn)。

T-SPOT.TB作為一種新的酶免疫檢測(cè)方法［6］，它的敏感度、特異度高，創(chuàng)傷小(僅需靜脈采血5 mL)，操作簡(jiǎn)單，需要的時(shí)間少(2 d就能出檢測(cè)結(jié)果)。近年來(lái)，已逐漸被各大醫(yī)院及檢驗(yàn)單位所接受。該檢測(cè)方法及其相關(guān)試劑盒已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床診斷結(jié)核分枝桿菌感染及結(jié)核病［7］。其應(yīng)用的原理是，機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生特異性的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，其在體外再次受到結(jié)核菌特異性抗原的刺激時(shí)，會(huì)釋放γ干擾素，通過(guò)檢測(cè)γ干擾素的水平或計(jì)數(shù)分泌γ干擾素的數(shù)量，判斷機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌，輔助診斷結(jié)核?。?］。由于選擇的特異性抗原只存在于結(jié)核桿菌，且是在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核桿菌中普遍缺失的RD1區(qū)基因片段所表達(dá)的蛋白［9］，因此T-SPOT.TB檢測(cè)的特異性會(huì)明顯高于結(jié)核菌素試驗(yàn)。

本研究結(jié)果顯示，T-SPOT.TB在診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的敏感度為82.5%，接近于先前研究報(bào)道診斷肺外結(jié)核病的84.0%［10］。其陽(yáng)性檢出率遠(yuǎn)高于抗酸染色(11.2%)、結(jié)核菌培養(yǎng)(40.0%)，略高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(71.2%)?？梢奣-SPOT.TB對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的檢出效能明顯優(yōu)于抗酸染色及結(jié)核菌培養(yǎng)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性率大體相同?？紤]到以上傳統(tǒng)檢測(cè)方式均需借助侵入性有創(chuàng)操作獲得，故T-SPOT.TB有其不可比擬的優(yōu)勢(shì)。在不同感染部位方面，T-SPOT.TB診斷脊柱結(jié)核的陽(yáng)性檢出率為83.64%，略高于四肢關(guān)節(jié)結(jié)核的80.00%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在不同病變部位導(dǎo)致的機(jī)體免疫應(yīng)答基本相同，可廣泛應(yīng)用于脊柱、四肢關(guān)節(jié)骨結(jié)核病的輔助診斷，具有良好的一致性。此外，依病程分組比較，T-SPOT.TB在不同組別中的陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率與病程長(zhǎng)短無(wú)明顯相關(guān)性，可作為診斷早期骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的重要輔助參考指標(biāo)。

綜上所述，T-SPOT.TB可以作為診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的重要輔助方法，可嘗試應(yīng)用于診斷篩選早期與不典型癥狀的疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核病領(lǐng)域。

［1］全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告［J］.中國(guó)防癆雜志，2012，34(8): 485-508.

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(本文編輯:趙麗潔)

Application value of tuberculous infection of T cells spot test in diagnosing osteoarticular tuberculosis

JIA Chen-guang1，YAO Li-ming1*，LI Xiu-wu2，LIU Feng-sheng1，ZHANG Zhi-hua3，ZHANG Jin-wen3
( 1． Department of Orthopedics，Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 2． Department of Pathology，Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 3． Department of Education Information，Chest Hospital of Hebei Province， Shijiazhuang 050041，China)

Objective To investigate the value of tuberculous infection of T cells spot test(TSPOT.TB)in the diagnosis of osteoarticular tuberculosis.MethodsThe study enrolled 80 patients who were confirmed osteoarticular tuberculosis and 44 did not have active tuberculosis.Acid-fast staining，mycobacterial culture，real-time quantitative PCR were respectively performed for the patients.The results were compared and analyzed.ResultsThe sensitivity，specificity，accuracy for osteoarticular tuberculosis diagnosis by T-SPOT.TB assay were 82.5%，75.0%and 79.8%.The positive rate of T-SPOT.TB was significantly higher than that of acid-fast staining，mycobacterial culture(P＜0.05).But，there were no statistical difference in different locations(spine or extremities joint)and courses between groups.ConclusionThe results suggested that T-SPOT.TB assay could provide useful aids in the diagnosis of osteoarticular tuberculosis.

tuberculosis，osteoarticular;tuberculous infection of T cells spot test;diagnosis

R529.2

A

1007-3205(2015)02-0148-04

2014-12-19;

2015-01-08

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(12277754)

賈晨光(1975-)，女，河北唐縣人，河北省胸科醫(yī)院副主任技師，醫(yī)學(xué)碩士，從事骨科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:yaolm24@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.010