不同劑量瑞舒伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化大鼠過氧化及血管平滑肌增生的影響

劉愛寧，楊文剛，鞠樹紅，聶丹鳳，周 暉

(1.上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200333;2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200003)

不同劑量瑞舒伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化大鼠過氧化及血管平滑肌增生的影響

劉愛寧1，楊文剛1，鞠樹紅1，聶丹鳳1，周 暉2*

(1.上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200333;2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200003)

目的觀察不同劑量瑞舒伐他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠過氧化及血管平滑肌增生的影響。方法 將46只大鼠隨機(jī)分為5組。對(duì)照組(n=6)給予普通飼料喂養(yǎng);高蛋氨酸組(n=10)在此基礎(chǔ)上加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的蛋氨酸;葉酸組(n=10)在高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)4周后，葉酸按每天0.8 mg/kg劑量灌胃;瑞舒伐他汀低劑量組(n=10)和高劑量組(n=10)以高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)4周后，瑞舒伐他汀分別按每天1、2 mg/kg劑量灌胃。末次灌胃后4 h處死動(dòng)物取血及頸主動(dòng)脈。檢測(cè)各組大鼠血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)、血漿丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)活性及炎癥因子表達(dá)，測(cè)量頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度。結(jié)果建模后12周，各組血漿Hcy水平均較建模前顯著升高，依次為高蛋氨酸組＞葉酸組＞低劑量組＞高劑量組＞對(duì)照組(P＜0.05);瑞舒伐他汀組各過氧化、炎癥指標(biāo)均顯著優(yōu)于高蛋氨酸組，高劑量組MDA、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素8及基質(zhì)金屬蛋白酶9含量較低劑量組降低，GSH-PX活性則明顯增強(qiáng)(P＜0.05);高蛋氨酸組、葉酸組與低劑量組頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度明顯高于對(duì)照組、高劑量組(P＜0.05)。結(jié)論高劑量瑞舒伐他汀對(duì)高Hcy性動(dòng)脈粥樣硬化的療效更佳，可達(dá)到更好的過氧化抑制作用，降低動(dòng)脈血管平滑肌厚度。

動(dòng)脈硬化;瑞舒伐他汀;肌，平滑

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種復(fù)雜的慢性炎癥性疾病，高同型半胱氨酸(hyperhomocysteinemia，HHcy)是近年新確認(rèn)的AS性心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但其導(dǎo)致AS的機(jī)制仍未十分清楚［1-2］。瑞舒伐他汀是目前臨床上治療及預(yù)防AS的一線用藥，具有抗炎、改善內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊等作用，能減輕AS患者的病情和臨床結(jié)局［3］，但關(guān)于瑞舒伐他汀對(duì)AS的劑量選擇及量效關(guān)系一直是爭(zhēng)議的焦點(diǎn)。本研究通過蛋氨酸飼養(yǎng)大鼠制備實(shí)驗(yàn)性AS動(dòng)物模型，分析瑞舒伐他汀對(duì)同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)致AS的療效，以及其濃度水平與過氧化反應(yīng)及血管平滑肌增生的關(guān)系，旨在為AS預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 健康8周齡的SD雄性大鼠46只，體質(zhì)量200～250 g，平均(228.1± 12.3)g，由長(zhǎng)征醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。蛋氨酸購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，瑞舒伐他汀鈣片(Rosuvastatin Calcium，商品名:可定)由英國(guó)阿斯利康公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型的建立 將46只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、葉酸組、高蛋氨酸組、瑞舒伐他汀低劑量組和高劑量組。其中對(duì)照組(n=6)給予普通飼料喂養(yǎng);高蛋氨酸組(n=10)在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的蛋氨酸;葉酸組(n=10)在高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)4周后，葉酸按每天0.8 mg/kg劑量灌胃，同時(shí)持續(xù)高蛋氨酸飲食;低劑量組(n=10)以高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)4周后，瑞舒伐他汀按每天1 mg/kg劑量灌胃，同時(shí)持續(xù)高蛋氨酸飲食;高劑量組(n=10)以高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)4周后，瑞舒伐他汀按每天2 mg/kg劑量灌胃，同時(shí)持續(xù)高蛋氨酸飲食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作過程遵照醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)程進(jìn)行。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 Hcy及過氧化、炎癥指標(biāo)測(cè)定 在末次灌胃后4 h處死大鼠取血，采血后置于含2%乙二胺四乙酸二鈉100μL試管中，3 000 r/min離心10 min后分離血清置于-70℃冰箱保存待檢。采用高效液相色譜法測(cè)定血漿Hcy濃度，采用比色法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)、白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)，采用免疫組織化學(xué)染色測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP-9)，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度測(cè)定 快速切開頸部，取出左頸總動(dòng)脈約2 cm，冰凍切片，HE染色處理，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定內(nèi)膜中膜厚度，不同部位測(cè)5次取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組建模前后血漿Hcy水平變化 建模前，各組血漿Hcy水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);建模后12周，各組血漿Hcy水平均較建模前顯著升高，依次為高蛋氨酸組＞葉酸組＞低劑量組＞高劑量組＞對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組建模前后血漿Hcy水平變化Table 1 Plasm a H cy change before and after modeling among different groups (±s，μmol/L)

表1 各組建模前后血漿Hcy水平變化Table 1 Plasm a H cy change before and after modeling among different groups (±s，μmol/L)

*P＜0.05與對(duì)照組比較 #P＜0.05與高蛋氨酸組比較 △P＜0.05與葉酸組比較 ☆P＜0.05與低劑量組比較(q檢驗(yàn))

Hcy建模前 建模后對(duì)照組組別 n6 6.75±1.13 7.22±1.27高蛋氨酸組 10 6.84±1.05 107.95±21.35*葉酸組 10 6.58±1.09 97.25±35.35*#低劑量組 10 6.68±1.03 85.11±31.64*#△高劑量組 10 6.12±1.02 73.72±24.73*#△☆F＞0.05 ＜0.05 0.680 14.830P

2.2 各組血漿過氧化、炎癥指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，高蛋氨酸組、葉酸組、低劑量組MDA及炎癥指標(biāo)明顯升高，GSH-PX明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而高劑量組與對(duì)照組之間MDA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。低劑量組和高劑量組各過氧化、炎癥指標(biāo)均顯著優(yōu)于較高蛋氨酸組及葉酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且高劑量組MDA、TNF-α、IL-8及MMP-9含量較低劑量組降低，GSH-PX活性則明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組血漿過氧化、炎癥指標(biāo)比較Table 2 Comparison of plasma peroxide and inflammatory indicators among different groups (±s)

表2 各組血漿過氧化、炎癥指標(biāo)比較Table 2 Comparison of plasma peroxide and inflammatory indicators among different groups (±s)

*P＜0.05與對(duì)照組比較#P＜0.05與高蛋氨酸組比較△P＜0.05與葉酸組比較☆P＜0.05與低劑量組比較(q檢驗(yàn))

組別 n MDA(μmol/L) GSH-PX(μmol/L) TNF-α(ng/L) IL-8(ng/L) MMP-9(ng/L)對(duì)照組 6 5.71±0.83 82.41±11.17 101.50±24.12 45.71±4.63 160.37±15.31高蛋氨酸組 10 13.51±1.72* 45.39±7.44* 457.80±176.01* 91.40±15.31* 310.15±25.70*葉酸組 10 12.48±1.28* 50.72±8.21*# 308.50±145.81*# 84.75±10.87*# 279.21±21.82*#低劑量組 10 9.16±1.17*#△ 62.17±10.76*#△ 277.90±110.46*#△ 76.13±9.24*#△ 221.23±19.46*#△高劑量組 10 6.19±0.96#△☆ 71.59±12.42#△☆ 178.70±75.56*#△☆ 63.51±6.32*#△☆ 191.15±18.37*#△☆F＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 5.621 9.032 12.910 5.983 13.864P

2.3 各組頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度比較 高蛋氨酸組、葉酸組、低劑量組頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度明顯高于對(duì)照組、高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而高蛋氨酸組、葉酸組與低劑量組之間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 各組頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度比較Table 3 Comparison of carotid intimal thickness among different groups (±s，mm)

表3 各組頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度比較Table 3 Comparison of carotid intimal thickness among different groups (±s，mm)

*P＜0.05與對(duì)照組比較 #P＜0.05與高蛋氨酸組比較 △P＜0.05與葉酸組比較 ☆P＜0.05與低劑量組比較(q檢驗(yàn))

頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度對(duì)照組組別 n7.35±0.67高蛋氨酸組 10 10.74±1.05*葉酸組 10 9.21±1.31*低劑量組 10 9.62±1.74*高劑量組 10 7.86±1.08#△☆F6＜0.05 5.160P

3 討 論

AS的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及炎癥、氧化應(yīng)激、血管平滑肌異常增生、免疫因素等諸多因素，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷和過氧化與血管平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)系尤為密切［4-5］。HHcy已被確立為AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但如何使用藥物干預(yù)逆轉(zhuǎn)HHcy性AS尚不清楚。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，約40%的心腦血管病患者血漿Hcy濃度不同程度的升高，且每升高5μmol/L，心腦血管病的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加30%～40%［6］。臨床上對(duì)HHcy性AS的防治多采用葉酸及維生素進(jìn)行非特異性治療，療效尚無法確定。

瑞舒伐他汀作為迄今為止最強(qiáng)的降脂藥物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于治療致AS的血脂紊亂，同時(shí)還具有穩(wěn)定斑塊、抗炎、抗氧化等非調(diào)脂作用［7］。但對(duì)于瑞舒伐他汀能否抑制頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜增生以及其治療的最適劑量仍存在爭(zhēng)議。本研究給予雄性SD大鼠蛋氨酸灌胃的方式構(gòu)建HHcy性AS大鼠模型，結(jié)果顯示，建模后12周，各組血漿Hcy水平均較建模前顯著升高，依次為高蛋氨酸組＞葉酸組＞低劑量組＞高劑量組＞對(duì)照組(P＜0.05)，且瑞舒伐他汀組各過氧化、炎癥指標(biāo)均顯著優(yōu)于較高蛋氨酸組、葉酸組，高劑量組MDA、TNF-α、IL-8及MMP-9含量較低劑量組降低，GSH-PX活性則明顯增強(qiáng)。一方面驗(yàn)證了Hcy參與AS的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)了AS的形成;另一方面說明瑞舒伐他汀較葉酸能更好地減弱Hcy對(duì)GSH-PX活性的抑制作用，加強(qiáng)氧化保護(hù)機(jī)制，抑制炎癥反應(yīng)，且其效應(yīng)呈劑量相關(guān)性［8］。

有研究認(rèn)為，血管內(nèi)皮的損傷會(huì)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的可塑性造成影響，使其去分化為增殖型表型［9］。于海嬌等［10］研究也發(fā)現(xiàn)，Hcy可以直接促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)膜下增殖，在AS的發(fā)病中有極其重要的地位。本研究中，高蛋氨酸組、葉酸組、低劑量組頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度明顯高于對(duì)照組、高劑量組(P＜0.05)。說明瑞舒伐他汀對(duì)上述表型的轉(zhuǎn)變具有抑制作用，抑制血管平滑肌異常增殖，且劑量越高，效果越明顯。最新研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞增殖和遷移過程有關(guān)，而瑞舒伐他汀可能參與下調(diào)該信號(hào)通路的活性［11］。

綜上所述，高劑量瑞舒伐他汀對(duì)HHcy性AS的療效更佳，可達(dá)到更好的過氧化抑制作用，降低頸動(dòng)脈血管平滑肌厚度的效果更好，但其具體的作用機(jī)制尚待于進(jìn)一步研究。

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(本文編輯:劉斯靜)

Influence of different doses rosuvastatin on peroxidation and proliferation of vascular smooth muscle cells for experimental atheriosclerosis rats

LIU Ai-ning1，YANG Wen-gang1，JU Shu-hong1，NIE Dan-feng1，ZHOU Hui2*
( 1． Department of Neurology，Putuo District Liqun Hospital of Shanghai，Shanghai 200333，China; 2． Department of Neurology，the Affiliated Changzheng Hospital of the Second Military Medical University of PLA，Shanghai 200003，China)

Objective To explore the influence of different doses rosuvastatin on peroxidation and proliferation of vascular smooth muscle cells for experimental atheriosclerosis rats.MethodsForty-six male rats were divided randomly into five groups，control group(n=6)was given with ordinary feed，high methionine group(n=10)with 2% methionine on this basis，folic acid group(n=10)with high methionine feed after four weeks，adding folic acid for lavage by 0.8 mg/kg per day，low dose group(n= 10)and high dose group(n=10)with high methionine feed after four weeks，adding rosuvastatin for lavage by 1 mg/kg per day，2 mg/kg per day，respectively.The rats were executed after last lavage for four hours to get blood and carotid artery.Plasma homocysteine(Hcy)，content of plasma malondialdehyde (MDA)，activity of glutathione peroxidase(GSH-PX)and inflammatory factors were detected，and the relative thickness of carotid artery walls was measured.ResultsAt12 weeks after modeling，the level ofplasma Hcy was significantly increased than before modeling，the order was high methionine group＜folic acid＜low dose group＜high dose group＜control group(P＜0.05).The peroxide and inflammatory indexes in rosuvastatin group were significantly better than those of high methionine group.Compared with low dose group，content of MDA，tumor necrosis factor-α，interleukin 8 and matrix metalloproteinases 9 decreased，the activity of GSH-PX was significantly enhanced in high dose group(P＜0.05).The relative thickness of carotid artery walls in high methionine，folic acid group and low dose group was obviously higher than that of control group，high dose group(P＜0.05).ConclusionHigh dose of rosuvastatin has better effect of atherosclerosis caused by hyperhomocysteinemia，and can achieve better inhibitory effect on peroxide，decrease the thickness of artery vascular smooth muscle more remarkably.

arteriosclerosis;rosuvastatin;muscle，smooth

R543.5

A

1007-3205(2015)02-0133-04

2014-06-19;

2014-08-23

上海市普陀區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)自主創(chuàng)新科技資助項(xiàng)目(KW-2012-02)

劉愛寧(1972-)，女，山東煙臺(tái)人，上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事腦血管疾病診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.004