應用熒光定量聚合酶鏈反應技術快速篩查重癥監(jiān)護室耐甲氧西林金黃色葡萄球菌定植者

孫 茜，呂志堂，孫雅堃

（1.河北省保定市第一中心醫(yī)院檢驗科，河北保定071002;2.河北大學生命科學學院，河北省微生物多樣性研究與應用實驗室，河北保定071002）

應用熒光定量聚合酶鏈反應技術快速篩查重癥監(jiān)護室耐甲氧西林金黃色葡萄球菌定植者

孫 茜1，呂志堂2*，孫雅堃1

（1.河北省保定市第一中心醫(yī)院檢驗科，河北保定071002;2.河北大學生命科學學院，河北省微生物多樣性研究與應用實驗室，河北保定071002）

目的 建立耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）熒光定量PCR快速檢測方法，篩查重癥監(jiān)護室（intensive care unit，ICU）MRSA定植者。方法 采集患者感染部位標本或鼻咽拭子標本，快速提取總DNA后應用熒光定量PCR方法檢測標本中nuc和mecA基因，對于雙陽性結果報MRSA陽性，采取早期干預措施。結果 建立的熒光定量PCR方法靈敏度高（4 CFU/反應）、快速、準確率100%。采取篩查和干預降低了ICU的MRSA感染率。結論 應用熒光定量PCR對MRSA早期篩查及干預，有助于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療，可有效防止或終止MRSA導致的醫(yī)院感染暴發(fā)流行。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;聚合酶鏈反應;篩查

自上世紀60年代初發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）以來［1］，MRSA經(jīng)歷了快速進化和流行擴張，在全球范圍內(nèi)已從醫(yī)院向社區(qū)擴散并迅速發(fā)展為社區(qū)感染最重要的病原菌［2］。根據(jù)衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)2006—2007年對84家醫(yī)院的統(tǒng)計結果顯示，國內(nèi)醫(yī)院MRSA的感染率占院內(nèi)感染的56%左右，個別醫(yī)院甚至高達70%，而重癥監(jiān)護室（intensive care unit，ICU）中MRSA的感染率較普通病房高出20%～30%，ICU已成為MRSA感染防控的重點［3］。探討MRSA感染高危人群、高危因素的防控措施，降低MRSA感染率，終止MRSA院內(nèi)傳播，避免醫(yī)院感染暴發(fā)流行事件發(fā)生，確保醫(yī)療安全已成為大多數(shù)研究者的共識［4－6］。本研究旨在建立快速、高靈敏度的MRSA定量PCR檢測方法，以期為ICU的MRSA防控提供指導。

1 材料與方法

1.1 菌株及標本 2009—2011年河北省保定市第一中心醫(yī)院分離并經(jīng)生理生化實驗鑒定的實驗用MRSA菌株135株、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillinsensitive S.aureus，MSSA）菌株83株，根據(jù)CLSI2011年標準區(qū)分。2012年1—12月共篩查臨床標本231份，均取自入住ICU前患者感染部位或鼻咽拭子。所有實驗均以金黃色葡萄球菌ATCC 33591作為 MRSA對照菌株，以金黃色葡萄球菌ATCC29213作為MSSA對照菌株。

1.2 DNA提取 首先將標本置于1.5 mL離心管中，加入400μL TE緩沖液（10 mmol/L Tris.Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0），渦旋振蕩1 min（純培養(yǎng)不用該步驟），將懸液12 000r/min離心5 min，棄上清，應用百泰克細菌基因組DNA提取試劑盒（溶液型）提取，其中酶解步驟加入20 U的溶葡球菌酶（上海生工），最后溶解DNA改用20μL DNA溶解液，其余步驟按說明書進行操作。

1.3 熒光定量PCR引物、探針及擴增方法 根據(jù)文獻報道的金黃色葡萄球菌nucA基因擴增引物Fnuc：5＇－GCGATTGATGGTGATACGGT－3＇，Rnuc：5＇－AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC－3＇［7］。進一步優(yōu)化引物序列和特征參數(shù)后使用的nucA基因擴增引物 Fnuc＇：5＇－GCGATTGATGGT－GATACKGT－3＇，Rnuc＇： 5＇－AGCCAAGCCTTGA－CGAACT。 采 用UltraSYBR Mixture（CWBIO）50μL體系，DNA模板用量5μL，擴增程序為預變性94℃ 10 min，變性94℃10 s，復性59.2℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，40個循環(huán)，溶解曲線59.2～94℃。

mecA基因擴增方法參考文獻中描述的方法進行，擴增引物 mecA－F：5＇－CAAGATATGAAGTGGTAAATGGT－3＇ 和 mecA－R： 5＇－TTTACGACTTGTTGCATACCATC－3＇;探針為 mecA－HP－1：5＇－CAGGTTACGGACAAGGTGAAATACTG ATT－［fam］3＇和 mecA－HP－2： 5＇ ［Red 640］－ACCCAGTACAGATCCTTTCAATCTATAGCG－p3＇。 采 用GoldStar TaqMan Mixture（CWBIO）50μL體系，DNA模板用量5μL，擴增程序為預變性95℃ 10 min，變性95℃ 10 s，復性50℃ 10 s，延伸72℃ 20 s，45個循環(huán)，溶解曲線45～75℃［8］。以上擴增均在Bio－Rad CFX96熒光定量PCR儀上完成。

1.4 干預措施 對于確診MRSA感染者及攜帶者，及時采取隔離措施，加強對其他監(jiān)護患者，特別是抵抗力低下患者的保護性措施。醫(yī)務人員相對固定，專人診療護理。此外，采取加強環(huán)境衛(wèi)生干預、嚴格無菌操作等措施［5］。

2 結 果

2.1 nuc擴增引物優(yōu)化結果 經(jīng)與GenBank中已注冊的核酸序列Blast比對及實驗驗證，優(yōu)化得到nuc基因定量 PCR擴增特異引物 Fnuc＇：5＇－GCGATTGATGGTGATACKGT－3＇ 和 Rnuc＇： 5＇－AGCCAAGCCTTGACGAACTAA－3＇。

2.2 標準曲線的制作 將已知濃度為3.9×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌基因組DNA進行10倍梯度稀釋，稀釋梯度分別為10－1～10－5，然后用改進的nuc基因特異引物和文獻報道的mecA引物進行熒光定量PCR［9］。擴增結束后，根據(jù)每個反應體系中DNA對應的金黃色葡萄球菌菌落形成單位（colony forming test，CFU）和反應的Ct值制作標準曲線。得到nuc基因定量PCR標準曲線方程為： y=－3.563x+38.39（R2=1.000）（其中y表示Ct值，x表示lg CFU）;得到mecA基因定量PCR標準曲線方程為：y=－3.623x+40.11（R2=0.997）（其中y表示Ct值，x表示lg CFU），線性良好。實驗條件下MRSA菌株純培養(yǎng)的檢測下限為4 CFU/反應體系。

2.3 臨床分離菌株驗證結果 分別對本醫(yī)院2009—2011年分離得到的83株MSSA菌株和135株MRSA菌株進行nuc基因和mecA基因熒光定量PCR檢測，結果所有菌株均為 nuc陽性，且所有MSSA菌株均為mecA陰性，所有MRSA菌株均為mecA陽性，結果100%相符，說明本研究改進的方法是成功的。

2.4 臨床標本篩選結果 2012年1—12月，采用定量PCR法篩查了231份取自入住ICU前患者感染部位或鼻腔拭子的臨床標本，并對相應標本進行常規(guī)分離鑒定和藥敏測定。定量PCR檢測中對于雙陽性結果者報MRSA陽性，從感染部位取標本，3種檢測方法差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），從鼻咽拭子取標本，定量PCR檢測陽性率高于其他2種方法（P＜0.05），見表1。

表1 定量PCR和常規(guī)分離培養(yǎng)法篩選MRSA感染結果比較Table 1 Comparison in MRSA infection screening between quantitative PCR and conventional isolated cu lture （株數(shù)，%）

2.5 ICU的MRSA防控效果分析 自2012年6月起，我院ICU根據(jù)MRSA定量PCR篩查結果，采取了相應防控措施，通過持續(xù)1年的統(tǒng)計，我院ICU的MRSA院內(nèi)感染發(fā)生率由之前的9.6例/1 000例患者降低至4.2例/1 000例患者，效果明顯;同時有助于提高ICU的床位利用率。

3 討 論

盡管醫(yī)院感染管理和消毒隔離制度不斷完善且常規(guī)監(jiān)控措施已實施，而MRSA感染發(fā)病率并未下降，已成為各醫(yī)院面臨的一大難題。雖然少數(shù)研究者認為對ICU患者主動篩查對降低MRSA感染沒有意義［9］，但由于MRSA定植者可以將MRSA傳染給他人，且MRSA定植者較非定植者更容易發(fā)生MRSA感染，多數(shù)研究者認為篩查MRSA定植者并進行干預，對于降低MRSA感染的發(fā)病率，終止MRSA在院內(nèi)的傳播，避免醫(yī)院感染暴發(fā)流行事件發(fā)生具有重要意義［4－6］。然而，傳統(tǒng)檢測MRSA的方法都是基于培養(yǎng)的方法，耗時長達48～72 h［10］，對MRSA防控指導意義不大，應用PCR技術快速檢測篩查MRSA攜帶者已成為發(fā)展趨勢［11－13］。目前，使用快速煮沸裂解法和商業(yè)化的DNA提取試劑盒［13－14］即使經(jīng)過樣品富集，其熒光定量PCR檢測下限也在10 CFU/拭子左右，而且對于富集分離陽性的標本有可能漏檢［15］，應用普通PCR方法檢測靈敏度則在103 CFU左右［7］。

本研究經(jīng)與GenBank中已注冊的核酸序列Blast比對之后發(fā)現(xiàn)：文獻中報到的nuc正向引物Fnuc：5＇－GCGATTGATGGTGATACGGT－3＇［7］的覆蓋度不高，與之匹配的大部分金黃色葡萄球菌nuc基因在引物序列的第18位堿基不是G而是T。也就是說，現(xiàn)有引物在檢測中可能遺漏部分已知金黃色葡萄球菌菌株。因此，我們在第18位設計兼并堿基K（G或T），以提高引物的覆蓋度，減少漏檢。此外，反向引 物 Rnuc：5＇－AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC－3＇［8］和部分菌株3＇末端不匹配，經(jīng)過改進得到Rnuc＇：5＇－AGCCAAGCCTTGACGAA－CTAA－3＇，不僅與目的菌株的匹配程度提高，而且Tm值為63.74℃，與正向引物更接近，改善了擴增效果。

改進的方法較文獻報道的方法檢測靈敏度有較大提高［13－14，16］，可能是在細胞裂解時使用溶葡球菌酶，提高了DNA提取效率的結果?？傮w上，定量PCR法對MRSA的檢出率與富集分離法相當，對于鼻咽拭子中MRSA的檢出率要顯著高于直接分離法;即使與富集分離法相比，定量PCR法對鼻腔拭子的檢出率也略高于富集分離法（P＜0.05）。定量PCR法不僅靈敏，而且整個過程只需5～7 h，較常規(guī)方法的48～72 h的效率大大提高。

針對金黃色葡萄球菌難破壁的特性，在DNA提取時加入溶葡萄球菌酶有助于提高DNA提取效率，本研究改進的nuc引物降低引物覆蓋度不高而導致的漏檢，從而提高了檢測靈敏度;根據(jù)nuc基因和mecA基因定量PCR篩查MRSA感染者和攜帶者，可實現(xiàn)MRSA患者（攜帶者）早發(fā)現(xiàn)、早診斷，結合采用及時隔離、強化衛(wèi)生干預等措施，對于降低MRSA院內(nèi)感染具有重要意義。

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（本文編輯：許卓文）

Rapid screening ofm ethicillin resistant Staphylococcus aureus colonised patients in ICU using fluorescent quantitative polymerase chain reaction

SUN Qian1，LV Zhi－tang2*，SUN Ya－kun3
1． Clinical Laboratory，No． 1 Central Hospital of Baoding City，Hebei Province，Baoding 071000，China; 2． College of Life Sciences，Hebei University ＆ Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province，Hebei Province，Baoding 071002，China）

Objective To establish the fluorescent quantitative polymerase chain reaction（QPCR）method for screening methicillin resistant Staphylococcus aureus（MRSA）colonised patients of intensive care unit（ICU）.MethodsCollecting the infection specimen or nasal swabs，extracting the DNA，and detecting the nuc gene and mecA gene within the sample by Q－PCR.For the double positive results specimen，MRSA positive was reported and intervening measures were adopted.ResultsThe QPCR method improved in this study was rather quick and showed high sensitivity（4 CFU/reaction）and accuracy（100%）.Q－PCR screen and early infection controlmeasures reduced the MRSA infection rate of ICU.ConclusionEarly screening and intervening of MRSA are helpful to early detection，diagnosis，quarantine and treatment，and also can effectively prevent or stop hospital infection outbreak caused by MRSA.

methicillin－resistant staphylococcus aureus;polymerase chain reaction;screening

R735.7

A

1007－3205（2015）03－0309－04

2014－04－23;

2014－04－25

孫茜（1972－），女，河北保定人，河北省保定市第一中心醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事臨床檢驗學研究。

*通訊作者。E－mail：lzt325@126.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.018