地塞米松對大鼠W alker 256乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛的作用

張 凡，李 毅，丁 杰，張海林

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北石家莊050017）

地塞米松對大鼠W alker 256乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛的作用

張 凡，李 毅，丁 杰，張海林*

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北石家莊050017）

目的 建立大鼠Walker 256乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，觀察地塞米松對骨轉(zhuǎn)移癌疼痛痛閾的影響。方法 制備Walker 256乳腺癌細(xì)胞的大鼠腹腔積液瘤細(xì)胞，將其注射入大鼠脛骨，測量術(shù)前及術(shù)后機械刺痛閾和輻射熱痛閾。結(jié)果 接種Walker 256乳腺癌大鼠術(shù)側(cè)機械刺激痛覺和輻射熱痛覺閾值顯著降低，且病理學(xué)結(jié)果顯示骨質(zhì)受到腫瘤破壞，提示W(wǎng)alker 256大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癌疼痛模型成功建立。地塞米松（5 mg/kg）能夠顯著提高骨轉(zhuǎn)移癌疼痛模型刺痛痛閾。結(jié)論 地塞米松能夠緩解大鼠骨轉(zhuǎn)移癌疼痛。

腫瘤;地塞米松;疼痛測定

骨轉(zhuǎn)移是癌癥的常見并發(fā)癥之一，骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛是癌癥轉(zhuǎn)移患者最常見的疼痛類型，約2/3骨轉(zhuǎn)移患者經(jīng)歷重度疼痛［1］。隨著腫瘤治療的進(jìn)步，帶瘤生存的患者越來越多，生存時間也越來越長，骨轉(zhuǎn)移瘤造成的并發(fā)癥日漸增多，骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛已成為影響其生活質(zhì)量的一個嚴(yán)重問題，已成為當(dāng)前惡性腫瘤治療的一個難點［2］。不同于了解較為深入的神經(jīng)病理性疼痛和炎性疼痛，骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛并未得到廣泛研究。直到近幾年，合并疼痛研究和腫瘤研究的良好的骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛動物模型才得以建立，提供了對骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛實驗研究的平臺［3］。到目前為止，人們對骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛的分子機制仍缺乏系統(tǒng)而深入的認(rèn)識，臨床上有效治療骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛的藥物十分有限，故對骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛治療的研究顯得尤為重要［4］。地塞米松是一種腎上腺皮質(zhì)激素類藥。具有抗炎、抗過敏、抗風(fēng)濕、免疫抑制作用，臨床使用較廣泛［5］。有報道地塞米松治療對晚期腫瘤患者生活質(zhì)量取得一定的效果，可明顯緩解晚期腫瘤患者食欲不振、惡心嘔吐、焦慮、疲倦乏力、心悸自汗等癥狀［6］。此外，應(yīng)用地塞米松或聯(lián)合其他鎮(zhèn)痛藥物，能夠有效改善癌性疼痛［7］。本研究成功建立大鼠Walker 256乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，觀察地塞米松對骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛痛閾的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 Walker 256乳腺癌細(xì)胞株，購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。Wistar雌性大鼠48只（體質(zhì)量180～200 g），Wistar幼年雌性大鼠2只（體質(zhì)量80 g）。均由河北省實驗動物中心提供。地塞米松購自Sigma公司。

1.2 制備Walker256乳腺癌細(xì)胞的大鼠腹腔積液瘤細(xì)胞［8］將Walker 256大鼠乳腺癌細(xì)胞置于離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加漢克斯平衡鹽（Hank balance salt solution，HBSS）緩沖液重復(fù)漂洗1次。用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，加適量HBSS緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107個/mL。選體質(zhì)量80 g左右的Wistar幼年雌性大鼠，抽取0.2～0.3 m L腫瘤細(xì)胞接種幼鼠腹腔中。6～7 d后，待幼鼠出現(xiàn)腹腔積液癥狀，腹部明顯膨大時，抽取含腫瘤細(xì)胞的腹腔積液。1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，用HBSS緩沖液將細(xì)胞重懸，再以1 500 r/min離心5 min。然后用HBSS緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為4× 107/mL，以備腫瘤接種時使用。

1.3 大鼠Walker256乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛模型［8］

1.3.1 動物分組 結(jié)果2.1部分實驗動物分組：將24只雌性Wistar大鼠（體質(zhì)量180～200 g）隨機分成3組各8只，分別為空白對照組（該組大鼠不做任何手術(shù)處理）、假手術(shù)組（該組大鼠在脛骨處注入5μL HBSS緩沖液）、手術(shù)組（該組大鼠在脛骨處植入5μL Walker 256細(xì)胞），造模時間持續(xù)28 d。結(jié)果2.2部分實驗動物分組：將24只雌性Wistar大鼠（體質(zhì)量180～200 g）隨機分成3組各8只，分別為假手術(shù)組（該組大鼠在脛骨處注入5μL HBSS緩沖液）、手術(shù)組（該組大鼠在脛骨處植入5μL Walker 256細(xì)胞）、手術(shù)+地塞米松組（該組大鼠在脛骨處植入5μLWalker 256細(xì)胞），大鼠出現(xiàn)疼痛行為預(yù)示造模成功，第17天開始每天腹腔注射地塞米松5 mg/kg至第26天。

1.3.2 制備大鼠脛骨癌痛模型 參照文獻(xiàn)報道［8］的方法并加以改進(jìn)，制作大鼠脛骨癌痛模型。用1.0%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，手術(shù)組、假手術(shù)組動物采用仰臥位，用75%酒精對右側(cè)后肢進(jìn)行消毒，去毛。在脛骨上段切開皮膚約1 cm，用鑷子鈍性分離肌肉，小心暴露脛骨骨面，用電動鉆孔器垂直于骨面鉆孔，至有明顯落空感后停止鉆孔，用10μL微量注射器抽取Walker 256細(xì)胞懸浮液5μL，緩慢植入至骨髓腔中，拔出微量注射器，然后迅速用無菌骨蠟封住鉆孔。如果有細(xì)胞懸浮液溢出，用75%酒精進(jìn)行消毒，殺死溢出的癌細(xì)胞。逐層縫合切口，然后涂抹適量碘酒，以防切口感染。假手術(shù)組動物注射等體積HBSS溶液，其余操作同手術(shù)組。對照組大鼠不進(jìn)行任何手術(shù)操作。

1.4 機械刺痛閾值測量 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)尼龍絲（美國North Coat Medical公司）刺激大鼠右后爪拓面。尼龍絲測試從最細(xì)柔開始逐漸順序增大標(biāo)號，直到引發(fā)大鼠右后腿抬起所使用尼龍絲的標(biāo)號即為機械痛閾值。閾值標(biāo)準(zhǔn)以g為計量單位。結(jié)果2.1部分實驗測量手術(shù)前和手術(shù)后第1、3、5、7、9、13、16、19、22、25、28天大鼠機械痛閾值。結(jié)果2.2部分實驗測量手術(shù)前和手術(shù)后第1、3、6、9、12、15、20、23、26天大鼠機械痛閾值。

1.5 熱痛閾值測量 應(yīng)用激光熱源燈（PL－200熱痛儀，成都泰盟科技有限公司）照射大鼠右后爪拓面測量熱痛閾值。激光熱源強度為（25.0±0.1）℃。引發(fā)大鼠右后腿抬起所照射時間即為熱痛閾值。閾值標(biāo)準(zhǔn)以s為計量單位。結(jié)果2.1部分實驗測量手術(shù)前和手術(shù)后第1、3、5、7、9、13、16、19、22、25、28天大鼠熱痛閾值。

1.6 病理組織學(xué)觀察 于腫瘤細(xì)胞接種后28 d，斷頸法處死大鼠，直接取大鼠新鮮脛骨，盡量除去肌肉組織，立即放入4%多聚甲醛中固定3 d，然后置于甲酸多聚甲醛溶液（甲酸與4%多聚甲醛比例為3∶7）中脫鈣12～24 h，經(jīng)脫水、透明、透蠟、包埋、切片后制成石蠟切片，然后進(jìn)行HE染色。在顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞生長及骨組織的破壞情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Origin 7.5軟件進(jìn)行分析，計量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析、q檢驗和t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠脛骨植入Walker 256乳腺癌細(xì)胞誘發(fā)骨轉(zhuǎn)移疼痛的變化

2.1.1 脛骨植入Walker 256乳腺癌細(xì)胞的大鼠機械刺激和輻射熱痛覺閾值 空白對照組和假手術(shù)組機械刺激痛覺閾值在手術(shù)后各時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;手術(shù)組的大鼠于術(shù)后第7天，機械刺痛閾值開始逐漸降低，至第16天時機械刺痛閾值達(dá)到較低值（P＜0.05）（圖1A）。在相同時間點，空白對照組和假手術(shù)組的輻射熱痛覺閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;而植入Walker 256細(xì)胞組大鼠，于術(shù)后第7天開始其輻射熱痛覺閾值逐漸降低，持續(xù)至第28天時達(dá)到最低值（P＜0.05）（圖1B）。

2.1.2 植入腫瘤細(xì)胞所致脛骨組織病理學(xué)變化于造模28 d，取各組大鼠脛骨，制備組織切片。在空白對照組（圖2A）和假手術(shù)組（圖2B），可見正常骨髓組織，未見其他骨結(jié)構(gòu)改變。而手術(shù)組（圖2C）的脛骨切片展示，在原有宿主骨周圍出現(xiàn)多量新生骨，有的在一側(cè)，有的包繞;髓腔內(nèi)可見腫瘤細(xì)胞，大部分伴有壞死，符合腫瘤表現(xiàn)。大鼠Walker 256乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型成功建立。

圖1 Walker256乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤痛模型大鼠機械刺痛A.機械刺痛閾值;B.熱痛閾值*P＜0.05與對照組、假手術(shù)組比較（q檢驗）Figure 1 The withdrawal threshold to mechanical stimulus and withdrawal time in response to radiant thermal stimulus were reduced in rat model of bone cancer pain induced by Walker 256 mammary gland carcinoma cell

2.2 地塞米松對大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型機械刺痛痛閾的影響 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型大鼠于術(shù)后機械刺痛閾值逐漸降低。于術(shù)后第17天起，連續(xù)腹腔注射給予5 mg/kg地塞米松;第20天后即顯著提高大鼠機械刺痛痛閾，持續(xù)至第26天（圖3）。

圖3 地塞米松提高大鼠Walker 256乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型機械刺痛閾值*P＜0.05與手術(shù)組比較（t檢驗）Figure 3 Dexamethasone elevated withdrawal threshold to mechanical stimulus in rat model of bone metastasis pain induced by Walker 256mammary gland carcinoma cells

3 討 論

骨轉(zhuǎn)移瘤疼痛是癌癥患者最常見的一種疼痛，也是腫瘤發(fā)生骨轉(zhuǎn)移時最常見的癥狀之一，利用合適的動物模型研究骨轉(zhuǎn)移癌疼痛的發(fā)生機制對其治療具有重要意義［9］。目前認(rèn)為，脛骨癌痛動物模型的疼痛表現(xiàn)與臨床上所見的骨轉(zhuǎn)移癥狀相似，可視為骨轉(zhuǎn)移癌疼痛模型。Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞來源于大鼠原發(fā)性乳腺癌組織，具有較好的骨侵襲能力，應(yīng)用該瘤細(xì)胞建立的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型，具有重要的科研價值［10］。

本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組的機械痛閾和熱痛痛閾與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;手術(shù)組大鼠術(shù)后手術(shù)側(cè)后足機械痛閾和熱痛痛閾值在造模6～7 d開始下降，與假手術(shù)組大鼠比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且造模后28 d，組織學(xué)結(jié)果顯示有腫瘤破壞骨質(zhì)的證據(jù)。表明本研究成功建立Walker256大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癌疼痛模型，且本研究細(xì)胞造模的成模時間以及痛覺行為與文獻(xiàn)報道基本一致，并表現(xiàn)出許多與人類骨轉(zhuǎn)移癌痛相似的特征［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能夠有效緩解大鼠Walker 256乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型機械刺痛。地塞米松對骨轉(zhuǎn)移疼痛模型熱痛的影響本研究未測試。地塞米松是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，是抗炎、抗過敏藥物，主要作為危重疾病的急救用藥和各類炎癥的治療。阿片類藥物是晚期癌癥鎮(zhèn)痛的基本用藥，但其存在耐受性、成癮性以及嚴(yán)重并發(fā)癥等嚴(yán)重缺點［11］。單獨增加阿片類藥物的劑量并不能達(dá)到理想的鎮(zhèn)痛效果。地塞米松適用于此類并發(fā)癥及對其敏感的惡性腫瘤。有研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用地塞米松或聯(lián)合其他鎮(zhèn)痛藥物對中、重度癌痛患者可達(dá)到完全或明顯緩解的效果。其可能的止痛機制包括：通過減輕腫瘤周圍組織水腫，緩解疼痛敏感結(jié)構(gòu)的受壓狀態(tài);或促使對類固醇有反應(yīng)的惡性腫瘤萎縮;或通過減少某些炎性介質(zhì)，如前列腺素和白三烯的組織濃度以降低傷害性感受器的活性［12－13］。

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（本文編輯：劉斯靜）

Effect of dexamethasone on rat bonemetastasis pain induced by Walker 256 mammary gland carcinoma cells

ZHANG Fan，LIYi，DING Jie，ZHANG Hai－lin*
（ Department of Pharmcology，the Basic Medical College of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

Objective To establish a ratmodel of bone metastasis pain induced by Walker 256 mammary gland carcinoma cells and observe the effect of dexamethasone on bone cancer pain.MethodsAscitic tumour cells were made from Walker256mammary gland carcinoma cells injected to tibia of rats.Then，the withdrawal threshold to mechanical stimulus and withdrawal time in response to radiant thermal stimulus were tested before and after operation.ResultsThe withdrawal threshold to mechanical stimulus and withdrawal time in response to radiant thermal stimulus were significantly reduced in the tibia bone inoculated with Walker 256 cells.The pathology results showed the evidence of tibia bone structure was destructed by tumor.It is suggested that the model of bone metastasis pain induced by Walker 256 mammary gland carcinoma cell was successfully established.Dexamethasone（5 mg/kg） elevated withdrawal threshold to mechanical stimulus in rat model of bone metastasis pain induced by Walker256 mammary gland carcinoma cell.ConclusionDexamethasone could alleviate bone cancer pain.

neoplasms;dexamethasone;pain measurement

R965.1

A

1007－3205（2015）03－0249－04

2015－01－07;

2015－01－20

國家自然科學(xué)基金（31401199）;河北省自然科學(xué)基金（H2015206427）;河北省教育廳優(yōu)秀青年基金（YQ2014030）;中國博士后科學(xué)基金第56批面上資助（2014M560194）

張凡（1986－），女，河北邢臺人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院講師，理學(xué)博士，從事離子通道功能調(diào)節(jié)的研究。

*通訊作者。E－mail：z.hailin@yahoo.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.001