葛根素特異性敲除技術(shù)方法分析

郭立忠朱月健

葛根素特異性敲除技術(shù)方法分析

郭立忠1朱月健2

目的分析葛根素特異性的敲除方法。方法分析葛根素特異性敲除技術(shù)的建立，并探討葛根素敲除技術(shù)方法的應(yīng)用。結(jié)果葛根素是葛根中的異黃酮，屬于植物雌激素，葛根是豆科植物野葛的根。葛根主要具有生津止渴、退熱舒肌以及止泄等作用。結(jié)論葛根素在臨床上能夠應(yīng)用于改善心律失常、擴(kuò)張血管、降血壓、改善微循環(huán)等，特別是在改善心腦血管等炎癥疾病方面有醫(yī)療價(jià)值。

葛根素；敲除技術(shù)

1 材料準(zhǔn)備

1.1 材料

葛根素敲除技術(shù)方法的建立主要涉及到的材料有瓊脂糖凝膠4B、葛根素、葛根、甲醇、層析柱、二甲基亞砜、氫氧化鈉、碳酸氫鈉以及鹽酸。

1.2 儀器

葛根素敲除技術(shù)方法建立所需儀器主要包括酶標(biāo)儀、氮吹儀、高效液相色譜儀、數(shù)顯恒流泵以及部分收集儀。

1.3 溶液

葛根素敲除技術(shù)方法建立所需配置溶液見表1。

表1 葛根素敲除技術(shù)方法所需溶液

2 葛根素敲除技術(shù)建立方法

2.1 制備免疫親和層析柱

首先活化凝膠，取適量保存在22%乙醇中的瓊脂糖凝膠，用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行反復(fù)的清洗，將乙醇洗凈，在將其放置在玻璃漏斗中，水泵真空抽干。再取10 g左右過濾好的凝膠用二甲基亞砜溶液清洗，之后加入氫氧化鈉、碳酸氫鈉以及鹽酸，待其反應(yīng)完成后，用雙蒸水進(jìn)行反復(fù)清洗，直至清洗液中沒有環(huán)氧基。其次又取適量活化凝膠，用＞5倍體積的偶聯(lián)緩沖液對(duì)其進(jìn)行沖洗，之后將其移入放有葛根素單抗的偶聯(lián)緩沖液中，在恒溫?fù)u床中反應(yīng)60 min，使其靜置［1］。用濾器過濾，且用3倍柱體積偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行沖洗，將沖洗下的偶聯(lián)上清收集，計(jì)算其中的偶聯(lián)抗體含量。接著，將與葛根素單克隆抗體充分偶聯(lián)的凝膠介質(zhì)懸浮在0.06%左右的硼氫化鈉溶液中，將凝膠介質(zhì)表面殘留的環(huán)氧基團(tuán)進(jìn)行還原，完成還原之后，用5倍體積0.01 MPBS溶液將硼氫化鈉沖洗干凈［2］。最后用3倍體積的0.1 M乙酸鈉緩沖液以及0.1 M Tris-Hcl緩沖液對(duì)其進(jìn)行反復(fù)交替沖洗。取大小合適的玻璃層析柱裝置沖洗好的凝膠，再用3倍體積平衡緩沖液沖洗凝膠，當(dāng)凝膠沉降之后，標(biāo)記凝膠上端，并根據(jù)層析柱內(nèi)徑以及凝膠的高度，將凝膠柱體積計(jì)算出來。然后將層析柱開關(guān)關(guān)閉，將其放置于4℃冰箱中儲(chǔ)存。

2.2 建立葛根素免疫親和層析敲除法

首先將50 g葛根飲片置于離子水中，加熱沸騰0.5 h后，用紗布將其藥渣過濾干凈，將葛根水于室溫靜置。之后將葛根水按照75%的比例與乙醇反應(yīng)，當(dāng)其出現(xiàn)絮狀之后放置0.5 h，用紗布過濾，將上清液取出，再置于0.22 μm的一次性濾器中過濾。接著用3倍體積的平衡緩沖液以1～2 ml/min的速度對(duì)免疫親和層析柱進(jìn)行沖洗。然后將葛根提取液用PBS稀釋之后加入免疫親和層析柱中，對(duì)樣品體積、流速進(jìn)行控制，保證凝膠上的單克隆抗體充分的特異性吸附。接著再用5倍體積的雙蒸水對(duì)凝膠內(nèi)多余的葛根素、非特異性吸附雜質(zhì)沖洗干凈。然后用5倍體積的洗脫緩沖液對(duì)凝膠進(jìn)行沖洗，洗脫緩沖液會(huì)改變免疫親和層析柱中的離子環(huán)境、pH值，也會(huì)改變抗體構(gòu)象，單克隆抗體的特異性結(jié)合會(huì)被破壞，也就是說葛根素液被分離出了免疫親和層析柱。最后就用3倍體積平衡緩沖液對(duì)葛根素單克隆抗體免疫親和層析柱進(jìn)行沖洗，保證免疫親和層析柱能再利用。

3 葛根素特異性敲除術(shù)的應(yīng)用

3.1 葛根素特異性敲除術(shù)的目的

由于患者心血管內(nèi)皮組織出現(xiàn)損傷與修復(fù)之間的平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生，而葛根素其主要生物機(jī)理為對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+的濃度進(jìn)行均衡調(diào)節(jié)，從而對(duì)心血管內(nèi)皮細(xì)胞的舒張作用產(chǎn)生影響。葛根素特異性敲除術(shù)的主要目的在于減少內(nèi)皮組織對(duì)葛根素化學(xué)成分的依賴性，使內(nèi)皮血管舒張對(duì)于葛根素調(diào)節(jié)的依賴性減少，通過NO在內(nèi)皮細(xì)胞舒張效應(yīng)釋放的同時(shí)，使得葛根素不再起主導(dǎo)作用，其他藥物成分將對(duì)內(nèi)皮血管舒張起到關(guān)鍵作用。另一方面，內(nèi)皮血管在舒張過程中，葛根素對(duì)雌激素釋放起到一定作用，而內(nèi)皮血管的穩(wěn)定與NO濃度有關(guān)，適量減少雌激素的釋放，可以減輕內(nèi)皮血管在舒張過程中所產(chǎn)生的劇烈程度，從而確保心血管在藥物舒張時(shí)的平滑性。

3.2 葛根素的應(yīng)用

葛根素是從豆科植物野葛根中提取的一種單一成份黃酮苷，具有活血化瘀、改善微循環(huán)、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管、降低心肌耗氧量等作用。葛根素注射劑臨床用于治療心腦血管疾病、視網(wǎng)膜血管病、眼底病及突發(fā)性耳聾等。

葛根在中藥中常用于治療心血管疾病、腹瀉以及發(fā)燒。葛根中的活性成分是葛根素，其在臨床上還能用于治療心絞痛、結(jié)腸癌、糖尿病、乳腺癌、酒精性肝損傷、肝纖維化以及缺血性中風(fēng)［3］。其中，治療心血管疾病的藥理機(jī)制是葛根素通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，葛根中的總黃酮能增加腦及冠狀動(dòng)脈的血流量。

4 結(jié)語

葛根素對(duì)動(dòng)物和人體的腦循環(huán)以及外周循環(huán)有促進(jìn)作用。葛根總黃酮在改善高血壓及冠心病患者的腦血管張力、彈性和博動(dòng)性供應(yīng)等方面均有溫和的促進(jìn)作用。葛根素不僅改善人體的正常腦微循環(huán)，而且對(duì)微循環(huán)障礙也有改善作用，主要表現(xiàn)為局部微血管血流和運(yùn)動(dòng)的幅度增加。葛根素對(duì)突發(fā)性耳聾患者的甲皺微循環(huán)也有改善作用，能加快微血管血流速度，清除血管袢淤血，提高患者的聽力。葛根素對(duì)缺氧心肌具有保護(hù)作用，葛根素能降低缺血心肌的耗氧量，保護(hù)心臟免受缺血再灌注所致的超微結(jié)構(gòu)損傷。

［1］許益笑，王萬鐵，徐正祄，等． 葛根素對(duì)缺血/再灌注損傷兔肺組織天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3變化的影響［J］． 中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2008，15（2）：104-107．

［2］胡海濤，封菲，丁美萍． 葛根素協(xié)同阿司匹林治療對(duì)急性腦梗死患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物的影響［J］． 中國中藥雜志，2008，33（23）：2827-2829．

［3］韓江全，于奎營，何敏，等． 葛根素對(duì)大鼠腦缺血再灌注側(cè)皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡及p-Akt（Ser473）表達(dá)的影響［J］． 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（8）：1069-1072．

Analysis of Puerarin Specific Knockout Technology

Guo Lizhong1ZHU Yuejian21 The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130021，China，2 Anhui Jiren Pharmaceutical CO．LTD，Bozhou 236800，China

ObjectiveTo analyze the puerarin prime specific knockout method．MethodsThe establishment and discussion of the specific knockout technology of puerarin and the application of the method of puerarin knockout．ResultsPuerarin was pueraria isoflavones belonging to phytoestrogens． Pueraria was the root of leguminous plants． The main effect had thirst，fever and diarrhea and other effects．ConclusionPuerarin can improve cardiac arrhythmia，expand blood vessels，reduce blood pressure，improve microcirculation，especially in the improvement of cerebrovascular diseases．

Puerarin，Knock out technique

R246．6

B

1674-9316（2015）27-0116-02

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．27．086

1 130021 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；2 236800亳州，安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司