植物內(nèi)生菌在園藝產(chǎn)品采后保鮮中的研究進展

彭敦洋，肖瑤，郭經(jīng)緯，陶天龍，田麗波，商桑，黃綿佳

（海南大學園藝園林學院，熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室，海南?？?70228）

園藝產(chǎn)品（果蔬、花卉）采后保鮮現(xiàn)已成為一個令全球農(nóng)業(yè)科研工作者和園藝產(chǎn)品生產(chǎn)者頭痛的問題。病理性的（病原微生物入侵、繁殖）、生理性的（自身生理衰退）和物理性的（環(huán)境溫度和濕度的不適應(yīng)性、機械摩擦損傷）原因，以及三者協(xié)同作用是導(dǎo)致園藝產(chǎn)品采后腐爛的主要因素。新鮮果蔬采后運輸中腐爛率在發(fā)達國家是10%～30%，而在我國高達30%～50%，每年造成的經(jīng)濟損失逾千億。目前，仍然是使用化學殺菌劑這一途徑來控制園藝產(chǎn)品采后病害，然而長期使用且頻繁加高使用化學殺菌劑的濃度導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗性而降低了防效，同時，嚴重威脅著人類健康與生態(tài)環(huán)境。因此，發(fā)展無公害型生物農(nóng)藥尤其是非化學合成天然的保鮮手段來控制園藝產(chǎn)品采后病害已成為一種新趨勢，逐漸成為一個新興研究熱點[1-2]。

植物內(nèi)生菌，是一類能夠定殖生長于植物體內(nèi)，并且不給植物體帶來顯著病害的微生物的統(tǒng)稱，主要是真菌類、細菌類和放線菌類三類。植物內(nèi)生菌可以完美地定殖生活于植物體內(nèi)，并且部分內(nèi)生菌還能夠保護其宿主植物體免受一些病害的威脅，由于其與普通的化學殺菌劑相比，作為生防菌的植物內(nèi)生菌具有廣譜抗菌性和高效的安全性等優(yōu)勢，用其菌體（或其產(chǎn)生的活性物質(zhì)）作為天然保鮮劑，將是絕佳的選擇。筆者從園藝產(chǎn)品采后保鮮所面臨的病害種類、植物內(nèi)生菌的來源、植物內(nèi)生菌的生防保鮮的機制、保鮮的實際應(yīng)用等方面進行綜述。

1 園藝產(chǎn)品采后所面臨的病害種類

園藝產(chǎn)品采后變色、壞死、萎蔫腐爛是其保鮮所面臨的主要問題，大多是由于采前或采后貯藏過程中，營養(yǎng)元素不適宜、溫度不適宜、水分不適宜、鹽堿和有毒害物質(zhì)或氣體、光照過強或過弱及運輸途中機械摩擦碰撞等非生物因素導(dǎo)致園藝產(chǎn)品自身調(diào)節(jié)機能受損，病原微生物（表1），如病毒、菌類等趁機侵染、瘋狂繁殖，繼而導(dǎo)致這些園藝產(chǎn)品表面發(fā)生變色、組織壞死、整體或局部萎蔫及腐爛。這些非生物因素的改變只是為后者（生物因素）提供了入侵的便利條件，假若能夠在采后有效地切斷這些病原菌的侵染、繁殖途徑，那么園藝產(chǎn)品采后保鮮問題即可得以解決。

表1 常見園藝產(chǎn)品采后面臨的主要病害調(diào)查

2 植物內(nèi)生菌的來源

目前國內(nèi)外研究的植物內(nèi)生菌基本上是采用表面消毒劑消毒，無菌水清洗并驗證消毒徹底以后，再從植物的根（含根系附屬土壤）、莖、葉、花、果實以及種子等部位進行分菌。Tiwari等[15]在分離圣羅勒葉部內(nèi)生菌時，先用流水沖洗葉片10 min后，將其于NaClO（1%）中浸10 min消毒處理，隨后用無菌的磷酸鉀緩沖液漂洗干凈，漂洗后將漂洗液置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。但從不同地點采集的植物或同一植物不同的部位利用的培養(yǎng)基不同，其分離的內(nèi)生菌也會有差異。陳萌等[16]應(yīng)用7種選擇性分離培養(yǎng)基分離四川省各個地區(qū)川楝樣品根、莖、葉、樹皮和果實等不同部位中的內(nèi)生菌，統(tǒng)計顯示表皮部位分離到的占總數(shù)的36.7%，而從果實部位分離到的占總數(shù)的7.6%，分離到的數(shù)量最少的是根部，但其有生防效果的菌比例最高。王春等[17]在大豆的不同生育期從其根、莖、葉和種子中分離得到不同的內(nèi)生菌。

3 植物內(nèi)生菌的保鮮機制

由于植物內(nèi)生菌在園藝產(chǎn)品采后保鮮方面應(yīng)用優(yōu)勢巨大，國內(nèi)外科研學者在植物內(nèi)生菌生防方面的報道較多[18-24]，但植物內(nèi)生菌在園藝產(chǎn)品保鮮中作用機制還知之甚少。筆者就國內(nèi)外近期已有報道的機制研究成果進行歸納，主要保鮮機制有3種，即與病原微生物競爭生態(tài)位點、分泌抑菌活性物質(zhì)控制病原微生物繁殖、通過誘導(dǎo)宿主植物打開主動防御體系等。

3.1 與病原微生物競爭生態(tài)位點

植物內(nèi)生菌定殖在園藝產(chǎn)品體表及內(nèi)部，通過與病原微生物爭奪水分、氧氣及各種營養(yǎng)物質(zhì)等方式與已入侵的病原微生物競爭生態(tài)位點，達到控制園藝產(chǎn)品表皮或其內(nèi)部病原微生物的數(shù)量，從而有效的延長了采后園藝產(chǎn)品的保鮮期。Bacon等[25]發(fā)現(xiàn)玉米內(nèi)生菌（枯草芽孢桿菌）能夠在玉米體內(nèi)較為快速的定殖，并且與其病原菌串珠鐮孢具有相同的生態(tài)位點，通過與其競爭生態(tài)位點抑制串珠鐮孢的繁殖，削減對玉米的侵害程度。許秀蘭等[26]在云杉內(nèi)生毛殼菌的生防機制研究中發(fā)現(xiàn)，毛殼菌株C45與病原菌的對峙培養(yǎng)時，其氣生菌絲發(fā)達且產(chǎn)生大量子囊果，出現(xiàn)包圍病原菌生長的趨勢，病原菌則趨向停止生長，抑菌率達60%，該菌株對病原菌的拮抗作用強，在與病原菌的營養(yǎng)競爭過程中占有一定的優(yōu)勢。白丹虹[27]在香蕉枯萎病FJ4的抗菌實驗中發(fā)現(xiàn)，CS16單獨培養(yǎng)能夠產(chǎn)生少許抑菌活性物質(zhì)，但是單獨培養(yǎng)產(chǎn)生的活性物質(zhì)抑菌效果卻并不如CS16與病原菌混合培養(yǎng)效果，故CS16的生防機制可能主要為CS16與病原菌之間的營養(yǎng)競爭。

3.2 分泌抑菌活性物質(zhì)控制病原微生物繁殖

分泌抑菌活性物質(zhì)來抑制病原微生物的增長、繁殖亦是植物內(nèi)生菌作為生防菌的又一重要作用機理。植物內(nèi)生菌在體外培養(yǎng)或在植物體內(nèi)（但目前大都是在體外離體培養(yǎng)驗證）能夠產(chǎn)生多種多樣的抑菌活性物質(zhì)，如幾丁質(zhì)酶、生物堿類、抗生素類等。這些物質(zhì)可以在植物體內(nèi)循環(huán)轉(zhuǎn)化，同時對已入侵的病原有直接或間接的或輕或重的抑制作用，從而使園藝產(chǎn)品保鮮期得到有效的延長。Nally[28]等發(fā)現(xiàn)釀葡萄酒的酵母菌通過揮發(fā)或分泌活性物質(zhì)，抑制病原真菌孢子萌發(fā)生長并降低芽管長度，以達到抑制病原微生物的繁殖。袁志林等[29]從百山祖冷杉針葉組織中分離出3株能產(chǎn)生強烈的揮發(fā)性物質(zhì)的炭角菌科產(chǎn)氣霉屬的內(nèi)生菌，這些活性物質(zhì)對多種植物病原微生物具有明顯的致死或抑制功能。李悅等[30]在煙草灰霉病菌培養(yǎng)時加入不同濃度的菌株Y41和Y11的胞外代謝產(chǎn)物，不同濃度的Y41和Y11胞外代謝產(chǎn)物對灰霉病菌絲的生長的抑制率也不同，Y41和Y11的胞外代謝產(chǎn)物原液抑制率超90%。

3.3 誘導(dǎo)宿主植物體打開主動防御系統(tǒng)

誘導(dǎo)宿主植物主動防御的機制較為復(fù)雜，一般地植物在某些物質(zhì)誘導(dǎo)作用下，能夠誘導(dǎo)植物體發(fā)生4種反應(yīng)：第一，誘導(dǎo)某些與防御相關(guān)的基因和蛋白的表達；第二，加強細胞壁結(jié)構(gòu)；第三，抑制蛋白質(zhì)的氧化；第四，誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物。李春玲[31]分離篩選到兩株對芒果采后炭疽病菌有顯著抑制作用的枯草芽胞桿菌，這兩株內(nèi)生菌能夠誘導(dǎo)芒果自身合成多酚氧化酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶3種防御酶，從而提高芒果果實對芒果炭疽病的抗性。Torres等[32]研究發(fā)現(xiàn)成團泛菌（pantoe aagglomerans）能夠誘導(dǎo)柑橘產(chǎn)生酚類物質(zhì)，提高果實的抗氧化活性。Duran等[33]表明低濃度的ROS可作為信號傳導(dǎo)的小分子，在病原菌入侵植物體的早期時，某些內(nèi)生菌與其反應(yīng)能夠改變ROS，并能誘導(dǎo)植物體相關(guān)抗性蛋白的表達。

4 植物內(nèi)生菌在采后保鮮中的實際應(yīng)用

到目前為止，實際應(yīng)用于生活生產(chǎn)的科研成果轉(zhuǎn)化并不是很多。人們利用內(nèi)生菌應(yīng)用于園藝產(chǎn)品生防的途徑有2種，一是利用自然存在于園藝產(chǎn)品表面的生防菌，另一種是人為引入生防菌。

4.1 利用生防菌的途徑

Chalutz等[34]的洗果實驗證明，清洗后貯藏的柑橘比未清洗的反而更易腐爛，而其洗果液接種培養(yǎng)未出現(xiàn)病菌，而稀釋后培養(yǎng)基出現(xiàn)病菌，由此可見園藝產(chǎn)品表面自然存在的內(nèi)生菌還是具有良好的生防效能的。但是，如何有效提高這種自然生防效能卻是無法依靠自然控制，還是要依靠人為操控。

人為引入可分在采前引入，也可在采后引入。采前引入是在園藝產(chǎn)品采前，大多采用表面噴施的方法引入生防菌。相比采后引入，其優(yōu)點是可以防治生長期至采后的病害，減少生長期病害損傷；某些園藝產(chǎn)品（例如櫻桃、草莓）采后不宜翻動，顯然采前引入生防菌比采后引入要好。采后引入是在園藝產(chǎn)品采后利用噴霧、浸果的方式處理，以達到引入生防菌，這兩種方式各有利弊，浸果可以使生防菌布滿產(chǎn)品表面，但若有個別已被侵染的產(chǎn)品，則會引起全體交叉感染，同時對生防菌的需求量也較大；而噴霧引入的方式卻可以很好的解決交叉感染的問題，減少了內(nèi)生菌的用量，但噴霧易導(dǎo)致個別園藝產(chǎn)品表面生防菌菌量較低，無法對個別產(chǎn)品進行有效防治。

4.2 近期植物內(nèi)生菌應(yīng)用于采后保鮮的科研成果轉(zhuǎn)化

近年來植物內(nèi)生菌在園藝產(chǎn)品采后保鮮中的應(yīng)用逐漸成為研究熱點，但大都僅限于科研及學術(shù)討論，而將科研成果實際大規(guī)模應(yīng)用到生產(chǎn)中的，除了枯草芽孢桿菌、畢赤氏酵母菌、假絲酵母菌、木霉菌等為數(shù)不多的幾種外就寥寥無幾了。筆者就國內(nèi)外近期實際應(yīng)用（專利）進行綜述。

Hellwege等[35]已公開其實際應(yīng)用專利，通過選用包含芽孢chitinosporus AQ746（NRRL Accession No.B-21618），蕈狀芽孢桿菌 AQ726（NRRL Accession No.B-21664），芽孢桿菌屬，枯草桿菌，蘇云金芽孢桿菌，NRRL Accession No.30547等菌種或這些菌株的突變體進行試驗，發(fā)明了包含涉及一種或至少一種生物抑制劑。并詳細介紹使用這種生物抑制劑用于降低植物損傷的方法。此發(fā)明的生物抑制劑可用于降低昆蟲、螨蟲、線蟲和植物病原菌對植物部分的或整體的破壞，以及降低園藝產(chǎn)品采后的損失。Andersch等[36]從鏈霉菌microflavus菌株NRRL B-50550及其突變體菌株產(chǎn)生的活性代謝物中，篩選到了對植物病原菌有抑制功能的生物制劑。使用該生物制劑，可降低植物部分或總體損傷，延長園藝產(chǎn)品采后保鮮期，降低園藝產(chǎn)品采后的損失。Wachendorff-neumann[37]的發(fā)明是一種病原菌的生防菌劑，使用這種生防菌劑，可降低植物損傷，延長園藝產(chǎn)品采后保鮮期。Brown[38]提供了芽孢桿菌的新分離的菌株，研發(fā)出一種應(yīng)用于西紅柿的生防菌劑。同時也表明TS-15（或其突變體）也可用來抑制植物病原菌，達到延長采后園藝產(chǎn)品保鮮期的效果。Levyt[39]發(fā)現(xiàn)了能有效地抵抗各種植物病原菌的生防菌劑Pseudozyma Aphidis，其發(fā)明生防菌劑P.Aphidis，可促進植物的生長，提高植物的活力，從而提高植物對病原菌的抗性，并且延長園藝產(chǎn)品的壽命及貨架期。

5 問題及展望

植物內(nèi)生菌是一個集多樣性、易接觸性于一體的群體，但目前內(nèi)生菌群體多樣性的系統(tǒng)性研究較少，有待科研學者去探索。由于植物內(nèi)生菌自身也是植物體內(nèi)的一種微生物，是否會對園藝產(chǎn)品采后生理造成影響，在應(yīng)用時是我們需要考慮的問題之一；內(nèi)生菌是一種活體生物，容易受植物體外界及體內(nèi)環(huán)境影響，內(nèi)外環(huán)境因子的變化會影響其保鮮效果；目前，大多數(shù)篩選到植物內(nèi)生菌的保鮮效果實驗僅在實驗室進行，也只處于一種試用階段，其成果轉(zhuǎn)化和應(yīng)用率偏低。由于園藝產(chǎn)品采后面臨的生物威脅多種多樣，所以具有廣譜殺菌效果的植物內(nèi)生菌也有待去深入研究。

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