人內(nèi)脂素的原核表達(dá)和分離純化

鐘佳蒨，張 濤

1成都外國(guó)語(yǔ)學(xué)校；2成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系

人內(nèi)脂素的原核表達(dá)和分離純化

鐘佳蒨1，張 濤2

1成都外國(guó)語(yǔ)學(xué)校；2成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系

目的：構(gòu)建Visfatin原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組人內(nèi)脂素（Visfatin）。方法：從人LO2細(xì)胞中提取總RNA后，經(jīng)RT-PCR法得到人Visfatin的cDNA序列，用以構(gòu)建帶HIS標(biāo)簽的Visfatin重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni柱親和層析純化融合蛋白。結(jié)果：PCR擴(kuò)增出的目的基因片段為1600 bp左右，與理論大小一致。SDS-PAGE、Western blot、質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)證明了蛋白是Visfatin融合蛋白。結(jié)論：成功的表達(dá)并純化得到帶HIS標(biāo)簽的Visfatin融合蛋白。

內(nèi)脂素；原核表達(dá)；蛋白純化

1 引言

隨著生活水平的提升，肥胖的人和糖尿病患者也越來越多。在肥胖方面的快速研究已經(jīng)證實(shí)，脂肪組織分泌著各種高度活躍的蛋白質(zhì)，其中一種就是Visfatin（內(nèi)脂素）。Visfatin是一種原本被認(rèn)定為前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子（PBEF），由淋巴細(xì)胞分泌的，可以作為具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。Visfatin已被報(bào)道高表達(dá)于骨髓、肝臟和肌肉組織中[1]，其次是腦、腎、脾、肺、睪丸、但在一些肥胖的動(dòng)物模型中內(nèi)臟脂肪比皮下脂肪相對(duì)表達(dá)量更高。在懷孕期間胎膜也有分布[2]。這種激素在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都被發(fā)現(xiàn)[3]。在人類基因組中位于第七號(hào)染色體長(zhǎng)臂7q22.1到7q31.33[4]之間。

此外，它還是一種煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Nampt），是一種涉及NAD+補(bǔ)救途徑中的一種酶。NAD+通過催化靶蛋白上乙酰化的賴氨酸殘基去乙?；纬葾DP-核糖[5]。這些沉默調(diào)節(jié)蛋白（Sir2）和人類同源基因消耗NAD+增加合成煙酰胺并通過從它們的靶蛋白的賴氨酸殘基上水解去除乙?；梢环N新的代謝物乙酰ADP-核糖[6]。可以說Nampt）間接有助于細(xì)胞的長(zhǎng)壽。

中國(guó)是一個(gè)糖尿病高發(fā)的國(guó)家，1995年統(tǒng)計(jì)為1600萬人，預(yù)計(jì)2025年會(huì)達(dá)到3760萬人[7]。和胰島素相比發(fā)現(xiàn)Visfatin/PBEF/ Nampt與IR（胰島素受體）的結(jié)合親和力是相似的[8]。許多研究證實(shí)，糖尿病患者Visfatin水平升高。Chen等研究發(fā)現(xiàn)[9],2型糖尿病患者的血漿Visfatin明顯高于非糖尿病人群,相關(guān)分析表明,Visfa?tin水平是2型糖尿病的獨(dú)立相關(guān)因素,推測(cè)Visfatin可能在2型糖尿病的發(fā)病過程中起到了一定的作用。

由于Visfatin和多種常見疾病相關(guān)，因此重組克隆人Visfatin并表達(dá)純化出蛋白，以便進(jìn)行相關(guān)的后續(xù)研究，具有一定的實(shí)用價(jià)值和科研研究意義。

2 材料與方法

2.1材料

E.coil DH5α菌株、E.coli BL21-DE3菌株來自實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pET-32a-tev來自實(shí)驗(yàn)室保存,Visfatin基因模板購(gòu)買自武漢華美生物技術(shù)公司，Nco I和Xho I酶購(gòu)買自Fermentas，T4DNA聚合酶購(gòu)買自TaKaRa,DNA純化回收試劑盒購(gòu)買自TIANGEN，質(zhì)粒小抽提取試劑盒購(gòu)買自道普生物科技有限公司。

2.2方法

2.2.1目的基因的獲取

用Trizol從LO2細(xì)胞中提取RNA時(shí)，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行RT-RCR，過得CDNA文庫(kù)，以CDNA文庫(kù)為模板，設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為CCATGG-GCCCACCCAACACAAGCAA,下游引物序列為CTCGAG-AATGATGTGCTGCTTCCAG（傾斜字體表示NcoI與XhoI的酶切位點(diǎn)），進(jìn)行PCR，94℃30s，52℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)。

2.2.2載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶NcoI與XhoI分別酶切載體pET-32a-tev以及PCR產(chǎn)物，37℃酶切3h，將酶切后的質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收。將回收后的載體與PCR產(chǎn)物按1:3比例混合[7]，室溫放置10min,轉(zhuǎn)化DH5α，涂含有氨芐青霉素的平板，挑取單克隆提質(zhì)粒，送公司（華大基因）測(cè)序。

2.2.3重組蛋白的表達(dá)與純化

將構(gòu)建好的，測(cè)序正確的重組載體轉(zhuǎn)化BL21-DE3，涂含有氨芐青霉素的平板，隨后挑取單克隆接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃,220rpm培養(yǎng)至OD600值為1.0左右時(shí)，加入IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，終濃度0.5mmol/L)，18℃誘導(dǎo)過夜，8000rpm離心15min收菌。

將收集的菌體用緩沖液A（20mM Tris-HCl,pH8.0+100 mM Na?Cl+10mM咪唑）重懸，用高壓均質(zhì)機(jī)（AVESTIN,）15000psi破四遍，4℃條件下20000rpm離心30min。離心后上清與沉淀經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)，蛋白以可溶形式存在。收集上清，過膜（0.22μm），表達(dá)載體pET-32a-tev，帶有組氨酸標(biāo)簽，表達(dá)的目的蛋白前端含有TEV的酶切位點(diǎn)。過膜后上清，用蛋白純化儀（AKTA explorer100, GE Healthcare）過親和層析柱（HisTrap HP 5ml,GE Healthcare），用緩沖液B（20mM Tris-HCl+pH8.0+100mM NaCl+500mM咪唑）梯度洗脫。采用SDS-PAGE以及Western-blot對(duì)純化蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果分析

3.1目的基因PCR擴(kuò)增及重組載體鑒定結(jié)果

通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示Visfatin基因片段為1700 bp左右，與理論DNA表達(dá)片段大小一致（圖1）。將擴(kuò)增得到的Visfatin基因片段pET-32a-tev質(zhì)粒分別經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接后得到的重組質(zhì)粒再次雙酶切鑒定，結(jié)果顯示在1600 bp處存在特異性片段（圖2）,構(gòu)建好的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與NCBI登陸序列一致。

圖1 Visfatin的PCR片段的瓊脂糖電泳Fig.1 The Results of PCR

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

3.2蛋白純化結(jié)果

用蛋白純化儀過親和層析柱，高濃度咪唑梯度洗脫，在咪唑濃度為100mM-200mM之間時(shí)出峰，12%SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，可以獲得純度較高的重組VISFATIN蛋白（見圖3），在70KD處有明顯的單一目的條帶，經(jīng)親和層析純化后，每升菌液可以獲得大約30mg的重組VISFATIN蛋白，將純化后的重組蛋白透析后，用TEV酶切，再次經(jīng)過親和層析出去His標(biāo)簽，得到純度較高的重組蛋白（圖2）。

3.3重組蛋白的質(zhì)譜鑒定

經(jīng)純化的pET32a-Visfatin蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分離后,用考馬斯亮藍(lán)染色，切下69 kD蛋白帶，通過膠內(nèi)酶切后，對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行ESI-TOF-MS質(zhì)譜分析，結(jié)果通過http：//www.matrixscience. com網(wǎng)站的MASCOT數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，鑒定結(jié)果見圖3-9。質(zhì)譜結(jié)果表明，69 kD電泳蛋白帶為pET32a-Visfatin重組蛋白。

圖4 質(zhì)譜鑒定

3.4 Western blotting驗(yàn)證

純化后pET32a-Visfatin重組蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分析后進(jìn)行蛋白印跡鑒定，可見在相對(duì)分子質(zhì)量70 kD左右處出現(xiàn)特異性雜交帶，表明為Visfatin蛋白（圖3-10）。

圖5 pET32a-Visfatin免疫印記

4.討論

本文通過對(duì)VISFATIN原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化的研究表明：PCR擴(kuò)增出的Visfatin基因片段(1600 bp)與理論大小一致。測(cè)序結(jié)果證明pET-32a-tev-Visfatin重組表達(dá)質(zhì)粒無缺失和突變。SDS-PAGE和Western blot分析經(jīng)純化后的His-tev-Visfa?tin融合蛋白分子量約為70KD，其中His標(biāo)簽序列為17KD左右，Visfatin分子量約為53KD，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果相符。Histev-VISFATIN重組融合蛋白經(jīng)過親合層析后可以達(dá)到電泳純，同時(shí)能夠保證較高的產(chǎn)量。

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