番茄紅素對慢性低氧小鼠骨密度和RANKL/OPG的影響

朱再勝，戴爽，鄭靖宇，黃卡特，吳玲，杜曉紅，李劍敏

（1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.老年病科；2.病理科）

·論 著·

番茄紅素對慢性低氧小鼠骨密度和RANKL/OPG的影響

朱再勝1，戴爽2，鄭靖宇2，黃卡特2，吳玲2，杜曉紅1，李劍敏2

（1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.老年病科；2.病理科）

目的：探討番茄紅素對慢性低氧（CH）小鼠骨密度（BMD）和核因子-kβ受體活化因子配體（RANKL）/骨保護(hù)蛋白（OPG）的影響。方法：選用8周齡C57BL/6雄性小鼠24只，隨機(jī)分為對照組（C組，n=8）、CH組（n=8）和番茄紅素組（LCP組，n=8）。C組在正常環(huán)境下飼養(yǎng)，CH組和LCP組低氧暴露時間為每日8 h，每周6 d，連續(xù)8周。于實驗?zāi)┤⊙?.5 mL，ELISA法測量血清抗酒石酸酸性磷酸5b（TRACP-5b）、骨鈣素（OC）；同時檢測骨組織丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）活性；用骨密度儀檢測股骨BMD；HE染色光鏡觀察骨組織形態(tài)學(xué)改變；用免疫組織化學(xué)技術(shù)和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測骨組織骨保護(hù)素（OPG）和核因子-κ B受體活化因子配體（RANKL）蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果：①CH組股骨干骺端骨小梁分布稀疏，變細(xì)及斷裂；骨組織SOD活性、BMD和血清OC明顯低于C組；而骨組織MDA、RANKL水平、RANKL mRNA/OPG mRNA以及血清TRACP-5b顯著高于C組（P＜0.01）。②LCP能部分改善CH小鼠骨組織形態(tài)學(xué)；LCP組骨組織MDA水平、RANKL表達(dá)、RANKL mRNA/OPG mRNA和血清TRACP-5b水平低于CH組；而骨組織SOD活性、血清OC水平和BMD高于CH組（P＜0.05或0.01）。結(jié)論：番茄紅素能降低CH小鼠骨組織氧化應(yīng)激水平，下調(diào)RANKL/OPG，減少骨吸收，提高BMD。

低氧；骨保護(hù)蛋白；核因子-kβ受體活化因子配體；骨密度；氧化應(yīng)激；番茄紅素；小鼠

Key words: hypoxia; osteoprotegerin; receptor activator for nuclear factor-κB ligand; bone mineral density; oxidative stress; lycopene; mice

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性代謝性骨病。低氧性疾?。ㄈ缏宰枞苑渭膊。┏０殡S骨代謝異常和骨質(zhì)疏松癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性低氧（chronic hypoxia，CH）會導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激[2]，慢性阻塞性肺病急性加重引起的氧化應(yīng)激加重，可導(dǎo)致骨吸收較穩(wěn)定期明顯增加[3]，故CH導(dǎo)致的氧化應(yīng)激會影響骨代謝和骨密度（bone mineral density，BMD）?？寡趸瘎┓鸭t素等能通過骨保護(hù)蛋白（osteoprotegerin，OPG）和核因子-k β受體活化因子配體（receptor acti-vator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）保護(hù)骨骼細(xì)胞抵御氧化損傷[4]。因此，本實驗擬通過CH模型，了解番茄紅素對C57BL/6小鼠CH模型的骨組織丙二醛（malondiadehyde，MDA）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和血清骨鈣素（osteocalcin，OC）、抗酒石酸酸性磷酸5b（tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRACP-5b）和BMD以及骨組織RANKL/OPG的影響，探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 免疫組織化學(xué)試劑：OPG和RANKL兔抗小鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；RT-qPCR試劑盒（美國，Invitrogen life technologies）；OPG、RANKL及內(nèi)參GAPDH引物（上?？党缮锕こ逃邢薰驹O(shè)計合成）；OC、TRACP-5b（上海西唐生物科技有限公司）；MDA、SOD、總蛋白等試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗動物與分組 SPF級健康7周齡雄性C57BL/6小鼠24只，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（浙）2010-0150。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按數(shù)字隨機(jī)法隨機(jī)分為3組，每組8只：①對照組（C組），常壓低氧艙外飼養(yǎng)；②CH組，置于常壓低氧艙中飼養(yǎng)，艙內(nèi)氧濃度維持8%～11%，CO2濃度維持1%～3%[5]，暴露時間為每日8 h，每周6 d，連續(xù)8周。③番茄紅素組（LCP組），每天于進(jìn)艙前灌胃番茄紅素（15 mg/kg小鼠體質(zhì)量，灌胃前先溶于色拉油），其余條件同CH組。C組、CH組每天分別給予同體積的色拉油灌胃，劑量均為0.5 mL/100 g體質(zhì)量。

1.3 標(biāo)本采集 在實驗8周末，斷頭處死小鼠，取血1.5 mL，取血清置-80 ℃低溫保存待用。取左側(cè)股骨下端，用中性甲醛固定24 h，取出后置20% EDTA溶液中4 ℃脫鈣，用于組織形態(tài)學(xué)觀察；取左側(cè)股骨上端，置-80 ℃保存用于RT-qPCR檢測。取雙側(cè)脛骨，置-80 ℃保存用于MDA、SOD檢測。取右側(cè)股骨，用0.9%氯化鈉溶液浸濕紗布包裹，-20 ℃低溫保存，用于BMD測定。

1.4 方法

1.4.1 OC、TRACP-5b檢測：用ELISA法測定，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.4.2 MDA、SOD檢測：用0.9%氯化鈉溶液1∶10稀釋勻漿，4 ℃離心（3 000 r/min，10 min）后，取上清于-80 ℃保存?zhèn)溆?。MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）法；SOD采用羥胺法；總蛋白測定采用考馬斯亮蘭法。檢測均采用722分光光度計，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.4.3 BMD測定：取出于-20 ℃保存的右側(cè)股骨，應(yīng)用骨密度儀（Hologic QDR-4500）小動物軟件（Hologic、Bedford、MA，USA）程序掃描整段股骨的BMD。

1.4.4 骨組織形態(tài)學(xué)觀察：取左側(cè)股骨石蠟包埋組織，切片厚度5 μ m，切片采用連續(xù)間隔切片，間隔5張取1張，每個標(biāo)本取3張切片。1張用于作HE染色，光鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)。

1.4.5 免疫組織化學(xué)法檢測OPG、RANKL蛋白的表達(dá)：分別行OPG和RANKL的免疫組織化學(xué)染色。油鏡下觀察骨組織OPG、RANKL蛋白的表達(dá)，結(jié)果判定[6]：每張切片隨機(jī)取光學(xué)顯微鏡1 000倍5個視野，進(jìn)行陽性細(xì)胞百分比計分與著色強度記分。陽性細(xì)胞百分比記分按每個視野內(nèi)陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的比例記分?！?%、6%～25%、26%～50%、＞51%分別記分為0、l、2、3分。著色強度記分：按陽性細(xì)胞著色（顏色）無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強（棕褐）分別記分為0、l、2、3分。上述兩種記分結(jié)果相加，0～1分為陰性（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分中等陽性（++）； 6分為強陽性（+++）。

1.4.6 RT-qPCR檢測OPG、RANKL和GAPDH mRNA表達(dá)：采用Trizol一步法提取總RNA。通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的RNA的完整性，紫外吸收測定法鑒定RNA的純度，選擇完整性和純度均符合實驗要求的RNA樣品-80 ℃保存。OPG上游引物5’-CCTGGGACCAAAGTGAATGC-3’，下游引物5’-TCTGT GGTGAGGTTCGAGTGG-3’，產(chǎn)物197 bp；RANKL上游引物5’-CATCGGGAAGCGTACCTACAG-3’，下游引物5’-GCTC CCTCCTTTCATCAGGTTAT-3’，產(chǎn)物101 bp；GAPDH（內(nèi)參）上游引物5’-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’，下游引物5’-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3’，產(chǎn)物293 bp。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用real-time RT-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，使用SYBR Green real-time RT-PCR相對定量的方法。比較各組管家基因GAPDH以及目的基因的Ct值，運用2-ΔΔCt方法，得出mRNA的相對表達(dá)量。最終結(jié)果由PCR儀配套軟件自動計算。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 股骨BMD、骨組織MDA和SOD以及血清OC、TRACP-5b變化 CH組骨組織SOD活性、BMD和血清OC明顯低于C組；而MDA和血清TRACP-5b顯著高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。LCP組骨組織MDA水平和血清TRACP-5b水平低于CH組；而骨組織SOD活性、血清OC水平和BMD高于CH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），見表1。

表1 各組股骨BMD及骨組織MDA、SOD、OC和TRACP-5b水平（n=8，）

表1 各組股骨BMD及骨組織MDA、SOD、OC和TRACP-5b水平（n=8，）

與C組比：aP＜0.01；與CH組比：bP＜0.01，cP＜0.05

2.2 骨組織HE染色 CN組小鼠股骨干骺端骨小梁飽滿、連續(xù)，骨小梁間隙分布均勻；CH組小鼠股骨干骺端骨小梁變稀疏、變細(xì)，骨小梁間隙增寬，可見骨小梁斷裂、消失；LCP組骨小梁較CH組粗，小梁間隔變小，但仍未達(dá)到C組水平，見圖1。

圖1 左股骨下端切片（HE，×200）

2.3 免疫組織化學(xué)檢測OPG、RANKL蛋白表達(dá) OPG的表達(dá)定位于軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞胞漿和胞核，3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2、表2）；RANKL的表達(dá)定位于軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞胞漿和胞核，C組大部分表達(dá)為弱陽性（+），CH組有4只表達(dá)為強陽性（+++），LCP組有3只表達(dá)為中等陽性（++），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）（見圖3、表2）。

圖2 左股骨下端OPG蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)，×1 000）

2.4 各組骨組織OPG mRNA、RANKL mRNA表達(dá)變化

CH組骨組織RANKL mRNA表達(dá)和RANKL/OPG比值明顯高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；LCP組骨組織RANKL mRNA表達(dá)和RANKL/OPG比值明顯低于CH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表3。

圖3 左股骨下端RANKL蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)，×1 000）

表2 各組骨組織OPG、RANKL蛋白表達(dá)（n=8，±s）

表3 各組骨組織OPG、RANKL mRNA表達(dá)（n=8，±s）

3 討論

番茄紅素是自然界中存在一種很強的抗氧化劑。近年來國內(nèi)外的研究證實，番茄紅素不僅促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，而且能夠抑制破骨細(xì)胞的活性，進(jìn)而阻止和減緩骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[4，7]。本實驗顯示，CH小鼠骨組織MDA高于C組，而SOD及BMD低于C組；病理學(xué)表現(xiàn)為股骨干骺端骨小梁變稀疏、變細(xì)，骨小梁間隙增寬，可見骨小梁斷裂、消失，與Song等[8]研究結(jié)果一致；相反，LCP組骨組織MDA明顯降低，SOD顯著升高，BMD和骨組織病理學(xué)有所改善；可歸因于CH導(dǎo)致骨組織氧化應(yīng)激增加，進(jìn)而導(dǎo)致BMD低，而番茄紅素能提高抗氧化防御來抵抗氧化損傷，改善BMD和骨組織病理學(xué)。

骨代謝表明CH不僅抑制骨形成作用和成骨細(xì)胞的活性，而且可以增強骨再吸收作用和破骨細(xì)胞的活性，主要表現(xiàn)為血清中OC水平低，而TRACP-5b水平高。本實驗顯現(xiàn)的，CH對于骨形成的抑制與先前的體內(nèi)外研究[8-9]結(jié)果類似。然而，CH對體內(nèi)外骨吸收的影響是不同的。體外研究表明CH能促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和骨吸收[10]；Song等[8]在體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)CH能抑制去卵巢大鼠的骨吸收。而本實驗顯示，CH能促進(jìn)骨吸收，可能與低氧的方式和持續(xù)時間不同以及研究對象不同有關(guān)。相反，番茄紅素能保護(hù)骨骼抵御CH導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性的增加，改善受抑制的骨形成作用。

RANKL/OPG的變化可以影響體內(nèi)破骨功能的程度進(jìn)而改變骨代謝的平衡[11]。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑可以通過調(diào)節(jié)RANKL/OPG改善骨代謝[12]。本實驗顯示，C組、CH組和LCP組3組間OPG mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CH組的RANKL mRNA和蛋白表達(dá)水平，RANKL/OPG比值高于C組，這與祝金香等[13]的體內(nèi)研究結(jié)果一致。然而，與體外實驗結(jié)果不同，低氧抑制小鼠成骨細(xì)胞表達(dá)OPG，刺激RANKL表達(dá)，從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞的分化成熟[10，14]，增加骨吸收。低氧對體內(nèi)外骨細(xì)胞OPG、RANKL表達(dá)影響不同的原因可能是，低氧會引起體內(nèi)IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子升高[15]，而IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子會干擾OPG/RANK/RANKL[16]，其機(jī)制有待研究。本實驗還顯示，與CH組比較，LCP組RANKL表達(dá)水平低，RANKL/OPG比值低，骨組織病理學(xué)和BMD有所改善，表明抗氧化劑番茄紅素能減少CH引起的骨組織氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)RANKL/OPG比值，減少骨吸收，從而改善了BMD。

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（本文編輯：吳健敏）

Effects of lycopene on bone mineral density and RANKL/OPG in chronic hypoxia modal mice

ZHU Zaisheng1, DAI Shuang2, ZHENG Jingyu2, HUANG Kate2, WU Ling2, DU Xiaohong1, LI Jianmin2.
1.Department of Gerontology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the effects of lycopene on bone mineral density (BMD) and RANKL/ OPG in chronic hypoxia (CH) modal mice. Methods: Twenty-four C57BL/6 male mice aged 8 weeks were randomly divided into three groups: Control group (C group, n=8) and CH group (CH group, n=8) and lycopene group (LCP group, n=8). Mice in CH and LCP were exposed in hypoxic environment, 8 h/day, 6 d/week while the C group lived in normal environment. At the end of 8 weeks, the serum levels of OC and TRACP-5b were measured by ELISA. The content of malondiadehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) in shinbone were analyzed using hydroxylamine assay and TBA colorimetry. The BMD of right femurs were detected by Hologic QDR-4500 bone densitometer. Histomorphology of bone tissue was observed with H.E stainin under light microscopy. The expressions of OPG and RANKL in bone tissue were detected with immunohistochemical technique and RT-qPCR respectively. Results: Firstly, Histologically, the volume of bones trabecular were decreased and the bones trabecular distribution were sparse, thinner and fracture in bone marrow in CH group. In comparison with the C group mice, BMD and serum OC level and the activities of SOD in bone (P＜0.01) were decreased signifcantly in CH group mice, while the serum TRACP-5b level, MDA level in bone, the expression of RANKL protein and RANKL mRNA in bone and RANKL mRNA/OPG mRNA (P＜0.01) were increased signifcantly. Secondly, LCP could partially improve the histomorphometric parameters in mice with CH. The serum TRACP-5b level, MDA level in bone, the expression of RANKL protein and mRNA in bone and RANKL mRNA/OPG mRNA in LCP group mice were lower signifcantly than the levels in HC group mice, while BMD and serum OC level and the activities of SOD in bone were higher (P＜0.01 or P＜0.05). Conclusion: Lycopene can reduce oxidative stress, regulate RANKL mRNA/OPG mRNA, decrease bone resorption and improve BMD in CH mice.

R361.2

ADOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.007

2014-10-29

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20120038）

朱再勝（1979-），男，浙江樂清人，主治醫(yī)師，碩士。

李劍敏，教授，Email：wzyxyljmin@163.com。