一株耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其特性研究

黃 河，林元山，周 熠，饒力群，盧向陽

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南長沙410128）

一株耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其特性研究

黃 河，林元山，周 熠，饒力群，盧向陽*

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南長沙410128）

利用乙醇-CMC-Na平板初篩，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復篩，從谷酒成熟酒醪中篩選獲得1株耐酒精纖維素酶活力較高的細菌Lys-1249。經(jīng)生理生化測定、形態(tài)觀察及16S rDNA基因序列的同源性分析，將其鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。經(jīng)正交試驗優(yōu)化該菌株的產(chǎn)酶條件，表明該菌株在麩皮2.0%，蛋白胨0.6%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.01%，培養(yǎng)基初始pH值為7.0，培養(yǎng)溫度37℃，發(fā)酵周期48 h的條件下，其耐酒精纖維素酶活力達到158.54 U/mL。該菌株在6.0%vol乙醇培養(yǎng)基中生長良好，活性可保持65.95%。

纖維素酶；篩選；鑒定；酒精；發(fā)酵

纖維素是由類似于多個葡萄糖分子組成的大分子多糖，為植物細胞壁的主要成分，屬于地球上最豐富的可再生資源[1]。纖維素酶是指能降解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系。纖維素酶的生產(chǎn)菌株有細菌、放線菌和絲狀真菌[2]。研究較多的是木霉屬的酸性纖維素酶，如綠色木霉的纖維素酶，因其纖維素酶酶系完全，活性較高，已成為目前主要的商業(yè)化纖維素酶[2]。近年來，纖維素酶、半纖維素酶的產(chǎn)量增加迅速，廣泛用于紡織、食品、飲料、釀酒、造紙工業(yè)以及醫(yī)療行業(yè)[3-4]。目前由于化石燃料的逐年減少，國內(nèi)外學者著力于探索纖維質(zhì)生產(chǎn)燃料酒精這一新途徑；該方法有兩步法和共發(fā)酵法[5]。但研究結(jié)果與淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)酒精的水平相差較大，菌株纖維素酶活力較低、耐酒精度低或耐酸耐堿的能力弱等原因使其難以實現(xiàn)纖維素工業(yè)化處理[6]。本試驗對耐酒精纖維素酶及其產(chǎn)生菌作了探索，為纖維素原料直接通過共同發(fā)酵法生產(chǎn)酒精提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篩選土壤樣品采集來源于從岳麓山、長沙縣榔梨鎮(zhèn)谷酒坊成熟酒醪等地。

羧甲基纖維素鈉鹽（carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na）、氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；剛果紅：中國遠航試劑廠；硫酸銨（分析純）：天津市博迪化工有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：西隴化工股份有限公司；麩皮、黃豆粉、空谷殼等原料購于當?shù)厥袌觥?/p>

篩選培養(yǎng)基：無水乙醇10.0%（滅菌冷卻后加入），CMC-Na 1.0%，（NH4）2SO41.0%，KNO30.5%，Na2CO30.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.01%，瓊脂2.0%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

斜面及計數(shù)培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，麩皮（40目）0.5%，瓊脂2.0%，pH 7.0，121℃滅菌20 m in。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮2.0%，蛋白胨0.5%，CMC-Na 0.5% pH 7.0，121℃滅菌20 min。

酒精耐受液體培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%，pH 7.0，121℃滅菌20 m in。冷卻后再加入無水乙醇至相應的含量（0～10.0%vol）。

1.2 儀器與設備

M J-106C霉菌培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HH-60數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱：常州市華普達教學儀器有限公司；QYC2112立式恒溫搖床：上海?，攲嶒炘O備有限公司；V-5000型可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；TOMY ES-315高壓蒸汽滅菌鍋、KF-3102電子天平：浙江凱豐集團有限公司；ZWL-08B臺式低速離心機：常州市華普達教學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選

篩選培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻至約60℃時，加入體積分數(shù)為10.0%的無水乙醇，混勻迅速倒平板。所取菌株材料按10倍稀釋法稀釋，取適當稀釋度的菌懸液涂布于篩選培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。待單菌落長出，用5.0 m L 0.5%無菌剛果紅染色浸泡篩選平板10 min，然后傾棄染色液，再用5.0 m L 1.0 mol/L的無菌NaCl洗滌脫色10～20 min，期間更換洗滌脫色液2～3次，觀察并測量菌落和水解圈直徑大小，選取水解圈和菌落比值較大菌落接種斜面，編號，置于4.0℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的搖瓶發(fā)酵復篩

將初篩菌株接種于250 m L三角瓶（培養(yǎng)基100 m L），200 r/m in、37℃培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液用4層紗布過濾，濾液在10 000×g條件下離心20 m in，上清即為粗酶液，用于酶活力測定。纖維素酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[7-8]，并作適當修改：取適當稀釋初酶液0.5 m L，加入乙醇5.0%vol-CMC-Na 1.0%的底物溶液1.5 m L，對照管酶液預先在100℃條件下煮沸10 m in滅酶活，在50℃水浴中反應30 min。再加入2.0 m L DNS試劑，煮沸5 min，迅速冷卻至室溫，定容至20 m L，于波長540 nm處測光吸收值。以每分鐘由CMC-Na產(chǎn)生1.0 μg還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量定義為一個活力單位（U/m L）。

1.3.3 菌株的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)搖瓶單因素發(fā)酵試驗結(jié)果，選取麩皮、蛋白胨、溫度、pH值4個因素，進行4因素3水平L9（34）正交試驗。

1.3.4 菌株形態(tài)、培養(yǎng)和生理生化鑒定

菌株的形態(tài)、培養(yǎng)和生理生化特征的鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]、《伯杰細菌鑒定手冊》第八版[10]進行。

1.3.5 菌株16S rDNA鑒定及分析

菌種委托北京三博遠志生物科技公司進行測序，測序結(jié)果通過BLAST與GenBank中的序列進行比對，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹及鑒定。

1.3.6 菌株及菌株分泌纖維素酶耐酒精性能分析

將搖瓶發(fā)酵復篩纖維素酶活力較高的菌株，接種于酒精耐受液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，然后進行平板計活菌。配制不同酒精含量的CMC-Na 1.0%的底物，按耐酒精纖維素酶活力的測定方法，測定纖維素酶在不同酒精含量時的保持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌平板初篩

在乙醇5.0%-CMC-Na1.0%平板上能夠生長且出現(xiàn)水解圈菌落，測量其水解圈和菌落的直徑，計算水解圈和菌落的直徑比，部分菌株（編號Lys-1214、1209、1467、1468）結(jié)果見圖1。由圖1可知，在乙醇-CMC-Na平板長出的單菌落較多，共獲得單菌落1 000多株，隨著酒精體積分數(shù)的增加，水解圈和菌落的直徑均有所減小，但二者的比例變化不大?？梢姡凭繉w維素酶產(chǎn)生菌的生長和酶的分泌或者酶活性產(chǎn)生阻遏或抑制作用。由于液態(tài)的酒精在固體平板中容易揮發(fā)，實際的酒精含量要低些。

圖1 乙醇-CMC-Na剛果紅平板初篩纖維素酶產(chǎn)生菌Fig.1 Screening of cellulose-producing strain on ethanol-CMC-Na plate colored by Congo red

2.2 菌株的搖瓶發(fā)酵復篩

根據(jù)初篩的結(jié)果，選擇水解圈和菌落的直徑之比＞4的菌株50余株進行搖瓶發(fā)酵復篩。結(jié)果表明，菌株Lys-1249具有較高的酶活力，菌株Lys-1249在培養(yǎng)基配方為麩皮2.0%，蛋白胨0.6%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.01%，培養(yǎng)基初始pH 6.0，培養(yǎng)溫度37℃，發(fā)酵周期48 h的條件下，纖維素酶活力達到123.35 U/m L。

2.3 正交試驗優(yōu)化菌株Lys-1249產(chǎn)酶條件

根據(jù)單因素發(fā)酵結(jié)果，選取麩皮、蛋白胨、溫度、pH值進行L9（34）正交試驗，結(jié)果見表1。從表1可以看出，通過9組發(fā)酵條件組合進行試驗，酶活力得到較大提高，最高達到132.10 U/m L；從R值的大小RA＞RC＞RB＞RD可以看出，影響因素由強到弱依次為麩皮、溫度、蛋白胨、pH值；從K值分析可得出最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C3D2，即麩皮2.0%，蛋白胨0.6%，溫度37℃、pH 7.0。經(jīng)驗證，在麩皮2.0%，蛋白胨0.6%，溫度37℃、pH 7.0條件下接種菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶，耐酒精纖維素酶活力達158.54 U/m L，與學者[11]從酒糟中分離細菌固體發(fā)酵纖維素酶活力（261.7 U/g）處于同一水平，但后者未揭示其酒精耐受性能。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

2.4 菌株Lys-1249形態(tài)和生理生化特征

通過形態(tài)觀察及生理生化試驗，菌株Lys-1249營養(yǎng)細胞為桿狀，桿端鈍圓，菌落呈細皺狀，在液體培養(yǎng)基表面形成銀白色的菌膜，能夠液化明膠，還原硝酸鹽，不產(chǎn)生H2S，水解淀粉，葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，需氧，28～39℃生長良好，芽孢橢圓或柱形，芽孢常見中生，革蘭氏染色呈陽性，與芽孢桿菌屬（Bacillus）中的枯草芽孢桿菌相似。

2.5 菌株Lys-1249的16S rDNA鑒定及分析

菌株Lys-1249的16S rDNA經(jīng)測序，序列已提交Gen-Bank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KM 924828，并通過BLAST與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中已知的細菌序列進行檢索比對，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，菌株Lys-1249枯草芽孢桿菌親緣最近，結(jié)合形態(tài)分析，該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 菌株Lys-1249的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phy logene tic tree of stra in Lys-1249

2.6 菌株Lys-1249耐酒精性能及菌株Lys-1249分泌纖維素酶耐酒精性能分析

將菌株Lys-1249接種于含有不同酒精度的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，用平板涂布法計活菌數(shù)（配方同斜面培養(yǎng)基），結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨著培養(yǎng)基酒精的增加，培養(yǎng)基中活菌數(shù)逐漸減少。菌株Lys-1249耐受酒精的程度與張靈等[12]報道的纖維素分解菌鏈霉菌-13大約相當，不過鏈霉菌-13所產(chǎn)的纖維素酶耐受酒精程度，未見后續(xù)報道。

配制酒精含量（0～10.0%）-CMC-Na 1.0%的底物，按纖維素酶活力的測定方法，測定菌株Lys-1249纖維素酶對不同酒精度的保持率，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著底物中酒精度的增加，菌株Lys-1249纖維素酶活性逐漸下降，當酒精度為6.0%vol，可保持原有纖維素酶65.95%活性；酒精度為10.0%vol，纖維素酶活性僅剩余10.01%。與學者[13]通過誘變獲得黑曲霉獲得天然纖維素降解菌株Aspergillus niger sp.CA-10所產(chǎn)纖維素酶的耐酒精性能（10%vol）處于同一水平，但Lys-1249所保留的纖維素酶活較高。

圖4 酒精含量對菌株Lys-1249纖維素酶活性的影響Fig.4 Effects of ethanol content on strain Lys-1249 cellulase activities

3 結(jié)論

國家發(fā)改委就我國生物燃料產(chǎn)業(yè)發(fā)展作出階段性的統(tǒng)籌安排，預計到2020年，我國生物燃料消費量將占到全部交通燃料的15%左右，建立起具有國際競爭力的生物燃料產(chǎn)業(yè)[14]。本研究以羧甲基纖維素鈉為單一碳源，培養(yǎng)基中通過添加乙醇，施加環(huán)境選擇壓力，獲得1 000多株耐不同程度酒精纖維素酶產(chǎn)生菌。盡管平板固體培養(yǎng)基中酒精在培養(yǎng)過程中有所揮發(fā)，但從結(jié)果看來，隨著酒精度的增加，纖維素酶產(chǎn)生菌的水解圈和菌落直徑菌有所減少，酒精對細菌生長及其纖維素酶活性影響很大，從研究結(jié)果可以判斷，該方法用于初篩耐酒精菌株及其纖維素酶是比較可靠的，國內(nèi)外報道鮮見。

枯草芽孢桿菌Lys-1249不僅菌株本身能耐受較高濃度的酒精度，其纖維素酶（纖維素內(nèi)切酶）也能耐受6.0%vol的酒精，其活力保持近65%，二者具有一致性。結(jié)果表明，產(chǎn)耐酒精纖維素酶酶活力最高的單因素條件為：培養(yǎng)基麩皮含量2.0%，蛋白胨含量0.6%，培養(yǎng)基初始pH值為7.0，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵周期48 h。通過正交試驗得到各因素對酶活力的影響強弱為A＞C＞B＞D，說明因素A即培養(yǎng)基麩皮含量對產(chǎn)酶影響最大，因素D即培養(yǎng)基起始pH值對酶活影響最小，正交試驗的最佳組合為A2B2C3D2。在此最佳條件下產(chǎn)酶活力為158.54 U/m L，驗證了正交優(yōu)化的結(jié)果是Lys-1249產(chǎn)纖維素酶的最佳條件。

本研究通過改良纖維素內(nèi)切酶測定方法，即在1.0% CMC-Na底物中添加5.0%vol的酒精，初步探索了耐酒精纖維素酶研究方法，為后續(xù)研究提供參考?？莶菅挎邨U菌Lys-1249是一株原始野生菌，其纖維素酶主要是內(nèi)切酶（試驗數(shù)據(jù)未列出），其水解纖維素的能力與商品化的木霉纖維素酶相比，是有較大差距的，但有望進一步通過誘變[15]或基因改良，獲得產(chǎn)酶能力更高的突變株或基因工程菌，顯示該菌具有一定的應用前景。

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《中國釀造》雜志社

Screening,identification of an alcohol-tolerance cellulase-producing strain and its characteristics

HUANG He,LIN Yuanshan,ZHOU Yi,RAO Liqun,LU Xiangyang*
(College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

An ethanol-tolerant strain Lys-1249 with cellulase activity was screened from the mature fermented grain mash by ethanol-CMC-Na plate preliminary screening and shake flask fermentation affination.Strain Lys-1249 was identified as Bacillus subtilis according to morphological observation,physiological and biochemical determination and 16S rDNA sequence analysis.The cellulose-producing condition was optimized by orthogonal experiment,and results showed that the ethanol-tolerant cellulase activity reached 158.54 U/m l when strain Lys-1249 was cultured in the condition of wheat bran 2.0%,peptone 0.6%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO47H2O 0.02%,MnSO40.01%,initial pH 7.0,temperature 37℃and time 48 h.The strain also grew well in medium with 6.0%vol ethanol,and the cellulase activity can keep at 69.95%.

cellulase;screening;identification;alcohol;fermentation

Q 93-331

A

0254-5071（2015）03-0062-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.014

2015-01-06

湖南省科技計劃博士后專項資金（2012RS4042）；湖南省研究生科創(chuàng)資金（CXS20113B298）

黃河（1990-），男，碩士研究生，主要從事微生物發(fā)酵的相關研究工作。

*通訊作者：盧向陽（1962-），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品綜合利用，作物生理生化研究。