新疆昆侖雪菊總黃酮含量測(cè)定方法研究

杜鵑，吳忠紅

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林科技學(xué)院，新疆昌吉831100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工所，新疆烏魯木齊830091）

新疆昆侖雪菊總黃酮含量測(cè)定方法研究

杜鵑1，吳忠紅2

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林科技學(xué)院，新疆昌吉831100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工所，新疆烏魯木齊830091）

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法測(cè)定新疆昆侖雪菊總黃酮含量的結(jié)果作了比較。結(jié)果表明：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的測(cè)定結(jié)果比AlCl3法對(duì)于高原雪菊和平原雪菊分別約高19.76mg/mL和9.34mg/m L，AlCl3法適宜酸度為pH>5.5。鄰苯二酚干擾實(shí)驗(yàn)表明，平均誤差為0.019mg/L，隨著鄰苯二酚量的增加，測(cè)得值無(wú)上升趨勢(shì)。AlCl3法的線(xiàn)性方程為：A=0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 2。因此，對(duì)含酚類(lèi)、酸類(lèi)較多的昆侖雪菊應(yīng)采用三氯化鋁法測(cè)定其總黃酮的含量。

雪菊；黃酮；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法；AlCl3法

雪菊[1-2]是生長(zhǎng)在新疆和田部分山區(qū)，海拔3 200m以上的雪山之隅及喀喇昆侖山脈的野生蛇目菊，所以又稱(chēng)昆侖雪菊、天山雪菊，是目前新疆惟一與雪蓮齊名，具有獨(dú)特功效的稀有高寒植物。長(zhǎng)期以來(lái)，昆侖雪菊被和田當(dāng)?shù)鼐用癞?dāng)花茶飲用，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒。

黃酮含量測(cè)定的方法有多種，其中絡(luò)合法在黃酮測(cè)定使用較普遍，可以克服被測(cè)液基底的影響，但是與被測(cè)液成分有很大關(guān)系，絡(luò)合劑及酸度的選擇非常重要。目前對(duì)雪菊的研究甚少，尤其是化學(xué)成分方面。有學(xué)者[3]采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測(cè)定了雪菊中黃酮活性物質(zhì)，據(jù)報(bào)導(dǎo)[4-5]雪菊中還含有綠原酸、鄰苯二酚等具有鄰苯二羥基結(jié)構(gòu)，堿性環(huán)境下與鋁離子形成絡(luò)合物，可能會(huì)對(duì)黃酮的測(cè)定造成干擾，影響總黃酮的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)分別用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法比較雪菊總黃酮含量測(cè)定結(jié)果，期望建立一種簡(jiǎn)單、快速測(cè)定新疆昆侖雪菊中總黃酮含量的方法，以期為昆侖雪菊質(zhì)量控制和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與來(lái)源

1.1 材料

采自2個(gè)不同地點(diǎn)的昆侖雪菊樣品分別為新疆和田皮山縣克里陽(yáng)高原雪菊（生長(zhǎng)海拔3 200m左右）、新疆達(dá)坂城平原雪菊（生長(zhǎng)海拔1000m左右）。

1.2 化學(xué)試劑

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鋁、醋酸、醋酸鈉、乙醇、氨水、鹽酸、醋酸鉛、鎂粉均為分析純、蘆?。?biāo)準(zhǔn)品）上海金穗生物有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

FA2004電子天平：上海儀器天平廠(chǎng)；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器分析有限公司；PHS-3C-11A型精密pH計(jì)：中國(guó)上海雷磁新涇儀器公司；KS-300EⅡ型超聲波清洗機(jī)：寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；Edwards Pirani1001冷凍干燥器（U.K.）；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 供試樣品溶液的制備

采用超聲波提取法[6-7]。將2種雪菊樣品粉碎，過(guò)60目篩，分別稱(chēng)取干燥的昆侖雪菊粉各5 g，加95%乙醇50mL，于超聲波清洗機(jī)中提取10min，趁熱減壓抽濾，用80%乙醇定容至100mL，搖勻后再稀釋5倍即得樣品溶液。

2.2 黃酮類(lèi)成分的定性實(shí)驗(yàn)[8]

2.2.1 鹽酸—鎂粉反應(yīng)

分別取2種雪菊色素提取液5mL，加入少許鎂粉，振蕩后，再加入2滴36%鹽酸，觀(guān)察顏色變化。

2.2.2 中性醋酸鉛反應(yīng)

分別取2種雪菊色素提取液5mL，逐漸滴加新配制的飽和中性醋酸鉛溶液，觀(guān)察顏色變化。

2.2.3 濃氨水試驗(yàn)

分別用2種雪菊色素提取液點(diǎn)在紙上，用濃氨水熏蒸，紫外燈下觀(guān)察。

2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱(chēng)取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品105.8mg，置100mL容量瓶中，用少量甲醇加熱溶解，冷卻后甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.058mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4 兩種黃酮含量的測(cè)定方法

2.4.1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[9]測(cè)定雪菊總黃酮含量

分別吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL比色管中，用50%乙醇稀釋至5.00m L，分別加入5%NaNO2，試液0.3m L，搖勻，靜置6min。再加5%A1（NO）3試液0.3mL，搖勻，靜置6min，再加4%NaOH4ml，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置12min。于510 nm[10]處測(cè)試，以顯色液中蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測(cè)定雪菊中總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，用最小二乘法進(jìn)行回歸，得線(xiàn)性方程：A= 0.004 71C+0.0136，r2=0.999 5。線(xiàn)性范圍為5.9μg/mL～59μg/mL。

取1.0m L樣品溶液10m L容量瓶，以不加樣品溶液為空白，按“2.4.1項(xiàng)”下的條件測(cè)定吸光度，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度，平行測(cè)定3次取其平均值。

2.4.2 AlCl3法測(cè)定雪菊中總黃酮含量

分別精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0m L于25m L的比色管中，加入1.5%AlCl38mL和醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH5.5）4mL，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置0.5 h。于415 nm下測(cè)試，以吸光度值為縱坐標(biāo)，以顯色液中蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，AlCl3法測(cè)定雪菊中總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2，用最小二乘法進(jìn)行回歸，線(xiàn)性方程為A= 0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 2。

圖2 AlCl3法蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 A lC l3method of rutin standard curve

取1.0m L樣品溶液10m L容量瓶，以不加樣品溶液為空白，按“2.4.2項(xiàng)”下的條件測(cè)定吸光度，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度，平行測(cè)定3次取其平均值。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

為了保證測(cè)定結(jié)果不受酚類(lèi)物質(zhì)影響，做如下實(shí)驗(yàn)：以蘆丁為被測(cè)試樣，鄰苯二酚為干擾劑（鄰苯二酚是雪菊中酚類(lèi)物質(zhì)的代表之一，含有鄰位多羥基），按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定方法測(cè)定，準(zhǔn)確移取0.1mg/mL蘆丁3.0mL 7份，分別準(zhǔn)確加入0.1 g/L鄰苯二酚溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL，再依次加入8mL 0.1mol/L AlCl3和4mL醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH5.5），用50%乙醇溶液定容。

2.6 酸度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

分別配制 pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，吸取2mL 0.1 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和1．5%AlCl38mL 5份，分別加入不同pH的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，50%乙醇溶液定容。

3 結(jié)果分析

3.1 黃酮類(lèi)成分的定性實(shí)驗(yàn)

經(jīng)鹽酸-鎂粉反應(yīng)、中性醋酸鉛實(shí)驗(yàn)、濃氨水反應(yīng)檢驗(yàn)，均呈陽(yáng)性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)及有關(guān)資料證實(shí)，新疆昆侖雪菊的乙醇提取液中確實(shí)存在黃酮類(lèi)成分。

3.2 兩種黃酮測(cè)定方法的比較

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法與AlCl3法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和A lC l3法測(cè)定結(jié)果比較Table1 Com parison of NaNO2-Al（NO3）3-NaOHmethod and AlC l3method for the determination of results

由表1可知，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的測(cè)定結(jié)果偏高，和田高原雪菊和達(dá)坂城平原雪菊的測(cè)定結(jié)果分別高出19.76mg/m L和9.34mg/m L，而用AlCl3法兩種雪菊測(cè)定得出的結(jié)果則相對(duì)偏低。

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法源于蘆丁含量測(cè)定法，并逐步用于黃酮類(lèi)化合物的測(cè)定。后來(lái)發(fā)現(xiàn)這并不是黃酮類(lèi)化合物的專(zhuān)屬反應(yīng)，因?yàn)榉簿哂朽彵蕉u基的物質(zhì)，均能用此法進(jìn)行顯色測(cè)量。雪菊中含有鄰苯二酚及花色素等多酚類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)都具有鄰苯二羥基結(jié)構(gòu)，顯色反應(yīng)后在510 nm有很強(qiáng)吸收，顯然會(huì)對(duì)黃酮的測(cè)定造成干擾，所以該法測(cè)定結(jié)果偏高。A1C13法在酸性環(huán)境下，只與酮羰基和其鄰位羥基發(fā)生絡(luò)合，反應(yīng)如下所示。

A1C13法測(cè)定時(shí)，蘆丁、黃芪苷、槲皮素等黃酮類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)強(qiáng)烈，而對(duì)酚酸類(lèi)、原花色素的反應(yīng)很小，該法對(duì)黃酮類(lèi)化合物的專(zhuān)屬性較強(qiáng)，適用于雪菊黃酮含量的測(cè)定，因此，選用A1C13法對(duì)雪菊中的黃酮進(jìn)行定量測(cè)定較適宜。

3.3 干擾實(shí)驗(yàn)

不同添加量的鄰苯二酚對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響見(jiàn)表2。

表2 不同添加量的鄰苯二酚對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響Table 2 Effects of adding different amount of catechol on experimental results

由表2可見(jiàn)，測(cè)得量與實(shí)際量略有差異，平均誤差0.019mg/mL。但隨著鄰苯二酚的增加，測(cè)得值無(wú)上升趨勢(shì)，因此用AlCl3法測(cè)定雪菊中黃酮的含量，不受酚和酸類(lèi)物質(zhì)的影響。

3.4 酸度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

實(shí)驗(yàn)表明，隨著酸度的降低，最大吸收峰位置逐漸紅移，pH大于5時(shí)，最大吸收峰位置穩(wěn)定，位于415nm；吸光度值最高并且穩(wěn)定。用酸度計(jì)對(duì)緩沖溶液和發(fā)色后的測(cè)試液進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)pH大于5.5時(shí)，測(cè)試液與緩沖溶液的差值最小。實(shí)驗(yàn)選定pH 5.5作為測(cè)定用緩沖溶液。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法測(cè)定新疆昆侖雪菊總黃酮含量的結(jié)果作了比較。結(jié)果表明，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的測(cè)定結(jié)果比AlCl3法對(duì)于高原雪菊和平原雪菊分別約高19.76mg/mL和9.34mg/mL，AlCl3法在酸性環(huán)境下進(jìn)行，酸度實(shí)驗(yàn)顯示，適宜酸度為pH>5.5。鄰苯二酚干擾實(shí)驗(yàn)表明，平均誤差為0.019mg/mL，隨著鄰苯二酚量的增加，測(cè)得值無(wú)上升趨勢(shì)。AlCl3法的線(xiàn)性方程為：A=0.000 638+ 0.862 3C，r2=0.999 2。因此，對(duì)含酚類(lèi)、酸類(lèi)較多的昆侖雪菊應(yīng)采用三氯化鋁法測(cè)定其總黃酮的含量。

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Study on Determination of Total Flavonoids Content in Xinjiang Kunlun Snow Chrysanthemum

DU Juan1，WU Zhong-Hong2
（1.Xinjiang Agricultural Vocational Technical College，Institute of Science and landscape architecture，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Research Institute of Agricultural Products Storage and Processing，Urumqi830091，Xinjiang，China）

With rut in as the standard substance，comparing the NaNO2-Al（NO3）3-NaOH determination of total flavonoids content in Xinjiang Kunlun snow chrysanthemum method and AlCl3method.The results showed that：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH assay results than the AlCl3method for the Plateau snow chrysanthemum and plain snow chrysanthemum was approximately 19.76mg/mL and 9.34 mg/mL，AlCl3acidity was pH>5.5.The experiment showed that the catechol interference，the average error was0.019mg/L，with the increase of the measured value of catechol，no upward trend.Linear equation AlCl3method was A=0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 2.Therefore，determination of the total flavonoids of phenols，acids more Kunlun snow chrysanthemum should be adopted AlCl3method.

snow chrysanthemum；flavonoids；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH method；AlCl3method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.024

2014-01-17

自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)（XJEDU2013S52）

杜鵑（1979—），女（漢），講師，碩士，從事食品加工教學(xué)及研究工作。