林蛙卵雌二醇的超臨界CO2萃取及酶聯(lián)免疫分析

邢燕，邱芳萍，紀(jì)可，杜琳

（長春工業(yè)大學(xué)，吉林長春130012）

林蛙卵雌二醇的超臨界CO2萃取及酶聯(lián)免疫分析

邢燕，邱芳萍*，紀(jì)可，杜琳

（長春工業(yè)大學(xué)，吉林長春130012）

以長白山林蛙卵為原料，研究超臨界CO2萃取林蛙卵中的雌二醇的工藝條件。探討萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時間對雌二醇萃取率的影響，并采用酶聯(lián)免疫分析法檢測林蛙卵雌二醇的含量。結(jié)果表明最佳萃取條件為萃取壓力30MPa，萃取溫度47℃，CO2流量為12 kg/h，萃取時間為90min。酶聯(lián)免疫分析得到林蛙卵中雌二醇的含量為38.11 ng/L。

超臨界CO2萃取；林蛙卵；雌二醇；酶聯(lián)免疫分析

長白山林蛙（Rana chensinensis Changbaishanensis）屬中國林蛙長白山亞種，主要在我國的東北長白山和小興安嶺地區(qū)有分布，林蛙卵的藥理作用研究在國內(nèi)未見有太多的報道，因其有顯著的抑制血小板聚集、降血脂及降低過氧化脂質(zhì)含量等相關(guān)作用，所以被認(rèn)為是一種天然的優(yōu)質(zhì)的保健食品原料，有相關(guān)資料報道，林蛙卵中含有18種氨基酸其中必需氨基酸的總量可達(dá)到28.93%、富含雌二醇孕酮等，是中國藥典中收錄的重要名貴中藥之一。雌激素可緩解或消除絕經(jīng)前后引起的更年期癥狀，可保護(hù)神經(jīng)元，對改善骨密度，預(yù)防骨質(zhì)疏松具有一定的作用，此外，雌激素還能增加大腦皮質(zhì)血液的供應(yīng)，雌二醇是雌激素中的生物活性最強(qiáng)的一種激素，林蛙卵常常被廢棄，我們從廢棄的原料中提取有很大利用價值的雌二醇鮮見有相關(guān)文獻(xiàn)報道。

超臨界萃取技術(shù)因其提取溫度低，尤其適宜于提取熱敏性有效成分；傳質(zhì)速率快，萃取率高；相對與傳統(tǒng)方法工藝流程簡單，因此便于過程中的調(diào)節(jié)；惰性無毒，產(chǎn)品中沒有溶劑殘留，從萃取到分離可以一步完成，萃取后的CO2不會殘留在萃取物上，且比較容易從產(chǎn)物中進(jìn)行分離出來，基于以上的特點，超臨界萃取的應(yīng)用范圍越來越廣泛。酶聯(lián)免疫測定法具有快速、靈敏、特異、簡便等優(yōu)點，同時還具有檢測成本低，便于大批量樣品檢測等特點，因此具有廣泛的實際應(yīng)用價值。本文中采用超臨界CO2流體萃取林蛙卵雌二醇，研究萃取壓力、溫度、CO2流量和萃取時間對萃取得率的影響，并用酶聯(lián)免疫分析進(jìn)行檢測，為林蛙卵雌二醇的實際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料及預(yù)處理

試驗原料為長白山新鮮林蛙卵，經(jīng)處理后備用。

1.2 設(shè)備

HA221-40-11超臨界萃取裝置：江蘇華安科研儀器有限公司；林蛙雌二醇ELISA試劑盒：上海士鋒生物科技有限公司；酶標(biāo)儀：北京普朗9602A酶標(biāo)儀。

1.3 試驗內(nèi)容

選用超臨界CO2萃取方法進(jìn)行林蛙卵雌二醇的萃取。

準(zhǔn)確稱取4 550 g干燥粉碎后的林蛙卵粉裝入料筒，將料筒裝入萃取缸，裝上料筒O型圈再放入通氣環(huán)，蓋好壓環(huán)及上堵頭，進(jìn)行萃取試驗。在林蛙卵雌二醇萃取過程中選取萃取壓力15、20、25、30、35MPa，萃取溫度37、42、47、52、57℃，CO2流量8、10、12、14、16 kg/h和萃取時間30、60、90、120、150min，以林蛙卵雌二醇的萃取得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗。雌二醇萃取得率按下列公式計算：

得率=（提取物質(zhì)量/林蛙卵粉質(zhì)量）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 壓力對雌二醇提取物得率的影響

調(diào)節(jié)萃取溫度為47℃，CO2流量為12 kg/h，萃取時間90min，萃取得率隨溫度的變化如圖1所示。

圖1 萃取壓力對萃取得率的影響Fig.1 Effects of extraction pressure on yield of estradiol

由圖1可知，隨著壓力的增加，萃取得率也相應(yīng)有大幅度的提高，當(dāng)萃取壓力達(dá)到30MPa時，繼續(xù)增加壓力，得率增加的趨勢較為平緩接近于平穩(wěn)，且在30MPa時對雌二醇提取物已達(dá)到較好的提取效果，故選擇30MPa為最佳萃取壓力。

2.2 萃取溫度對雌二醇提取物得率的影響

調(diào)節(jié)萃取條件維持壓力30 MPa，CO2流量為12 kg/h下萃取90min，溫度對萃取得率的影響如圖2所示。

圖2 萃取溫度對萃取得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction yield of estradiol

由圖2可知，雌二醇提取物得率在37℃～47℃范圍內(nèi)隨溫度的增加而增加，47℃可達(dá)到最大值，47℃后再升高溫度，萃取得率反而呈下降的趨勢。這是因為當(dāng)溫度升高時，分子運動加快，分子間相互碰撞的機(jī)會相對增加，揮發(fā)性和擴(kuò)散系數(shù)會提高，溶解能力會增大，但溫度升高的同時，CO2分子間距增大，作用力減小，密度減小，又會導(dǎo)致溶解能力下降，綜合考慮上述因素選擇47℃為最佳萃取溫度。

2.3 CO2流量對雌二醇提取物得率的影響

調(diào)節(jié)萃取條件在萃取溫度47℃，壓力30MPa下萃取90min，可得CO2流量與得率的關(guān)系如圖3所示。

圖3 CO2流量對萃取得率的影響Fig.3 Effects of CO2flow rate on yield of estradiol

由圖3可知，隨著CO2流量的增加萃取得率增加，達(dá)到12 kg/h時再增加CO2流量萃取得率開始下降，這是因為CO2流量對萃取得率有著復(fù)雜的影響，當(dāng)增加CO2流量時，CO2流體通過萃取釜的速度增大，在萃取釜中停留的時間短與原料接觸的時間少，對萃取能力的提高不利；與此同時，CO2流量的增加導(dǎo)致CO2流體通過林蛙卵粉層的速度加快，傳質(zhì)推動力會相應(yīng)增加，傳質(zhì)系數(shù)增加對萃取能力的提高是有利的。通過實驗得出在萃取雌二醇時CO2流量為12 kg/h時，得率較高。因此，選擇最佳CO2流量為12 kg/h。

2.4 萃取時間對雌二醇提取物得率的影響

選擇在萃取壓力30MPa，溫度47℃，CO2流量為12 kg/h條件下，萃取不同的時間，得率見圖4。

由圖4可知，隨著萃取時間的增加，萃取物得率增加，但當(dāng)萃取時間達(dá)到90min以后，隨著時間的延長得率增加很緩慢，考慮到現(xiàn)實中的經(jīng)濟(jì)因素，再繼續(xù)延長萃取時間是不合理的，所以選擇最佳萃取時間為90min。

圖4 萃取時間對萃取得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on yield of estradiol

2.5 林蛙卵雌二醇的酶聯(lián)免疫分析結(jié)果

采用林蛙雌二醇（E2）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）檢測超臨界CO2萃取林蛙卵中雌二醇的含量。ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中林蛙雌二醇（E2）水平。用純化的林蛙雌二醇（E2）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入雌二醇（E2），再與HRP標(biāo)記的雌二醇（E2）抗體結(jié)合，形成抗體—抗原—酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的雌二醇（E2）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中林蛙卵雌二醇（E2）含量。

在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔10孔，依次稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為48、32、16、8、4 ng/L。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=（-1.819 8）+25.484 01x，R2=0.999 1。

將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)得到超臨界萃取林蛙卵中雌二醇的含量為38.11 ng/L。

3 結(jié)論

通過單因素試驗確定了超臨界萃取林蛙卵雌二醇的最佳工藝條件為萃取壓力30MPa，萃取溫度47℃，CO2流量為12 kg/h，萃取時間為90min，并通過酶聯(lián)免疫分析法測得其雌二醇含量為38.11 ng/L。超臨界流體由于其獨特的優(yōu)點，使其與常用的其他有機(jī)溶劑相比，是一種環(huán)境友好型溶劑。使用超臨界CO2作為有機(jī)溶劑的替代品，應(yīng)用在生物、醫(yī)藥、食品包裝和環(huán)保等領(lǐng)域是現(xiàn)在及未來的一個發(fā)展趨勢。酶聯(lián)免疫分析降低了分析成本，加快了分析速度，靈敏度高，特異性強(qiáng)，在檢測方面受到越來越多科研工作者的青睞。

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Supercritical Fluid Extraction of Estradiol from Rana Chensinensis Egg and Analysis by ELISA

XING Yan，QIU Fang-ping*，JI Ke，DU Lin
（ChangChun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

The text used Rana chensinensis egg as material，effects of extraction pressure，temperature，flowrate and time on yield of estradiol extracted by supercritical carbon dioxide were studied，and the content of estradiol was detected by ELISA.The results showed that the optimal extraction conditions were follow：extraction pressure 30 MPa，temperature 47℃，carbon dioxide flowrate 12 kg/h and extraction time 90min.The content of estradiol detected by ELISA was38.11 ng/L.

supercritical CO2extraction；Rana chensinensis egg；estradiol；ELISA

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.003

2013-12-13

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20110252）

邢燕（1988—），女（漢），碩士研究生，研究方向：生物技術(shù)應(yīng)用。

*通信作者