蛹蟲草對紫外誘導(dǎo)果蠅氧化損傷的保護作用

黃雅琴，李盡哲，段鴻斌，殷東林

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000；2.鄭州大學(xué) 河南省離子束生物工程重點實驗室，河南 鄭州 450052）

蛹蟲草對紫外誘導(dǎo)果蠅氧化損傷的保護作用

黃雅琴1,2，李盡哲1,*，段鴻斌1，殷東林1

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000；2.鄭州大學(xué) 河南省離子束生物工程重點實驗室，河南 鄭州 450052）

為了探討蛹蟲草對紫外輻射所致氧化損傷果蠅的保護作用，以不同質(zhì)量分數(shù)的蛹蟲草培養(yǎng)基飼養(yǎng)經(jīng)不同時間紫外輻射的果蠅，觀察統(tǒng)計其體內(nèi)的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。結(jié)果表明：蛹蟲草粉質(zhì)量分數(shù)為0.4%的培養(yǎng)基能極顯著提高紫外輻射20 min雄果蠅的SOD活性（13.09%，P＝0.005 9＜0.01）并極顯著降低MDA含量（17.11%，P＝0.003 2＜0.01）；蛹蟲草粉質(zhì)量分數(shù)為0.2%的培養(yǎng)基能極顯著提高紫外輻射40 min雄果蠅的SOD活性（8.99%，P＝0.006 6＜0.01）并極顯著降低MDA含量（9.06%，P＝0.006 1＜0.01）；蛹蟲草對雄性果蠅的抗氧化保護作用優(yōu)于對雌性的。由此可見，適宜質(zhì)量分數(shù)的蛹蟲草粉能夠修復(fù)紫外輻射對果蠅造成的損傷，對機體起到抗氧化保護作用。

蛹蟲草；紫外輻射；果蠅；超氧化物歧化酶；丙二醛

蛹蟲草（Cordyceps militaris）為子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科，蟲草屬的模式種，又名北冬蟲夏草、北蟲草等。它含有大量的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖，是國際醫(yī)學(xué)界公認的人體免疫增強劑，能提高肝臟解毒能力和機體抗病毒、抗輻射能力，還能清除自由基、擴張血管、消除黃褐斑、老年斑，抗衰防皺[1]。現(xiàn)有的眾多研究也表明，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、抗突變、抗衰老等多種藥理作用，比如枸杞多糖、黑木耳多糖、海帶多糖、松茸多糖等，因此，目前多糖正作為一種天然有效的輻射防護劑，被越來越多的人所關(guān)注[2]。

紫外線是一種由原子的外層電子受到激發(fā)后產(chǎn)生的電磁波，波長比可見光短，能引發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng)，過量的紫外線照射能夠誘發(fā)白內(nèi)障，使皮膚老化粗糙，產(chǎn)生皺紋、斑點，甚至造成皮膚癌[3-7]。已有研究表明，紫外線能對亞油酸[8]、脂質(zhì)體[9]、小白鼠血液免疫酶[10]、家兔皮膚[11]產(chǎn)生氧化性損傷。在真菌中，前人已研究過灰樹花[12]、香菇[13]、靈芝[14]、紅菇[15]、銀耳[16]、滑子菇[17]的抗輻射保護作用，對于蛹蟲草，前人只做過體外抗氧化分析[18]和小鼠的抗氧化酶活性研究[19]，然而，將蛹蟲草作為抗輻射保護劑的開發(fā)，目前在國內(nèi)還是一片空白，蟲草多糖能否抗紫外線輻射及其抗輻射效果如何也有待探索。本實驗以紫外線為誘變源，以野生果蠅為受試動物，研究蛹蟲草對輻射處理后果蠅體內(nèi)的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的影響，旨在為蛹蟲草作為輻射保護劑的開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型果蠅由信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)教研室友情贈送。蛹蟲草采自信陽農(nóng)林學(xué)院應(yīng)用真菌實訓(xùn)基地。樣品的制備：將蛹蟲草40 ℃烘12 h至恒質(zhì)量，粉碎后過50 目篩備用。

無水乙醇 武漢市中天化工有限責(zé)任公司；瓊脂粉上海醫(yī)學(xué)化驗所試劑廠；蔗糖 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；丙酸 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；安琪酵母粉、乙醚 天津市津梅化工有限公司。以上所有試劑均為國產(chǎn)分析純。SOD測定試劑盒、MDA測定試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

ZF系列紫外透射反射儀（電源：220 V，50 Hz；功率：6 W；波長：302 nm） 上?？等A生化儀器制造有限公司；GXM-400D型智能光照培養(yǎng)箱、DHG-9023AS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 寧波東南儀器有限公司；FA2104N電子分析天平 上海菁海儀器有限公司；電子萬用爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

基本培養(yǎng)基按照每100 mL蒸餾水中添加玉米粉11.2 g、蔗糖8.9 g、瓊脂1.0 g、丙酸0.8 mL、干酵母粉1.0 g的比例配制。設(shè)基本培養(yǎng)基為對照（CK），在CK的基礎(chǔ)上配制不同質(zhì)量分數(shù)的蛹蟲草培養(yǎng)基，將蛹蟲草粉添加于剛煮沸的基本培養(yǎng)基中，然后分裝、冷卻、凝固，使蛹蟲草粉終質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.2%、0.4%，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

1.3.2 果蠅分組和紫外輻射

收集8 h內(nèi)羽化的未交配的果蠅，乙醚麻醉后區(qū)分雌雄，轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基和3 個蛹蟲草培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，每組雌、雄果蠅各60 只，共8 瓶。3 d后，麻醉果蠅，每組雌、雄果蠅再分別分成3 份（每份20 只），轉(zhuǎn)移到空的100 mL容量三角瓶（高約10 cm）中，用紗布包扎封口。先將紫外透射反射儀打開，預(yù)熱10 min，再將裝有果蠅的三角瓶倒置在反射儀暗箱中央的玻璃板上，每組的3 份雌、雄果蠅，第1份不輻照，第2份輻照20 min，第3份輻照40 min。輻照結(jié)束后用乙醚麻醉果蠅，將每一份果蠅再等分成兩份，一份直接用于測定各項指標(biāo)，另一份轉(zhuǎn)移到各自相應(yīng)的培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱中25 ℃暗培養(yǎng)10 d，測定各項指標(biāo)。本實驗重復(fù)3 次，所有數(shù)據(jù)取平均值。

1.3.3 果蠅體內(nèi)SOD活性和MDA含量的測定

每組稱取雌雄果蠅各40 mg，加0.5 mL生理鹽水，在冰浴中以2 000 r/min勻漿10 s，間歇10 s，反復(fù)進行3 次，制成勻漿；按照試劑盒說明書方法測定每組果蠅組織蛋白質(zhì)含量（雙縮脲法，mg/mL）、SOD活性（黃嘌呤氧化酶法，U/mg pro）及MDA含量（TBA法，nmol/mg pro）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 13.0數(shù)據(jù)處理軟件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，分析差異顯著性（P＜0.05表明差異顯著；P＜0.01表明差異極顯著；P＞0.05表明無顯著差異）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草對紫外輻射果蠅體內(nèi)SOD活性的影響

圖1 蛹蟲草對經(jīng)紫外輻射的雌性果蠅體內(nèi)SOD活性的影響Fig.1 Effect of Cordyceps militaris on SOD activity in female Drosophila melanogaster after UV radiation

圖2 蛹蟲草對經(jīng)紫外輻射的雄性果蠅體內(nèi)SOD活性的影響Fig.2 Effect of Cordyceps militaris on SOD activity in male Drosophila melanogaster after UV radiation

如圖1、2所示，對雌、雄果蠅體內(nèi)的SOD活性進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在輻射剛結(jié)束時，果蠅體內(nèi)的SOD活性表現(xiàn)為隨著輻射時間的延長先上升后下降，在CK培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，輻射20 min的雌性果蠅體內(nèi)SOD活力下降10.84%，雄性果蠅體內(nèi)SOD活力下降12.69%；輻射40 min的雌性果蠅體內(nèi)SOD活力下降16.52%，雄性果蠅體內(nèi)SOD活力下降13.09%，均達到極顯著水平（P＜0.01）。

如圖1a、2a所示，將未經(jīng)輻射的果蠅在不同質(zhì)量分數(shù)的蛹蟲草培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅰ和Ⅱ時，10 d后果蠅體內(nèi)的SOD活力上升，其中Ⅱ型培養(yǎng)基效果最明顯，雌性果蠅體內(nèi)的SOD活力上升10.03%，雄性果蠅體內(nèi)的SOD活力上升11.02%；當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅲ時，10 d后雌性果蠅體內(nèi)的SOD活力下降5.6%，雄性果蠅體內(nèi)的SOD活力下降3.38%。由此可見，在未經(jīng)紫外輻射的情況下，蛹蟲草能夠提高果蠅體內(nèi)的SOD活性，其中Ⅱ型培養(yǎng)基效果最佳。

如圖1b、2b所示，將輻射20 min的果蠅在不同質(zhì)量分數(shù)的蛹蟲草培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10 d后果蠅體內(nèi)的SOD活力均上升，當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅱ和Ⅲ時，果蠅體內(nèi)SOD活力的上升率均達到極顯著水平（P＜0.01），其中以Ⅲ型培養(yǎng)基效果最明顯，雌性果蠅體內(nèi)的SOD活力上升12.71%，雄性果蠅體內(nèi)的SOD活力上升13.09%；如圖1c、2c所示，輻射40 min的果蠅培養(yǎng)10 d后體內(nèi)SOD活力均上升，當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅱ時，雄性果蠅體內(nèi)的SOD活力上升率達到極顯著水平（P＜0.01），為8.99%，雌性果蠅體內(nèi)的SOD活力上升率達到顯著水平（P＜0.05），為4.89%；當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅲ時，雌性果蠅體內(nèi)的SOD活力上升率達到顯著水平（P＜0.05），為6.62%，雄性果蠅體內(nèi)的SOD活性與輻射后立即測定值差異不顯著；當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅰ時，雌、雄果蠅體內(nèi)的SOD活性與輻射后立即測定值差異不顯著（P＞0.05）。

因此，綜合以上分析認為蛹蟲草能夠提高果蠅體內(nèi)的抗氧化酶活性，修復(fù)短時間輻射所產(chǎn)生的氧化損傷，而長時間的輻射會導(dǎo)致機體自身的抗氧化酶系統(tǒng)被破壞，相應(yīng)地蛹蟲草清除氧自由基的能力也變?nèi)?；同時發(fā)現(xiàn)，雄性果蠅體內(nèi)的SOD活性的上升率高于雌性果蠅。

2.2 蛹蟲草對紫外輻射果蠅體內(nèi)MDA含量的影響

圖3 蛹蟲草對經(jīng)紫外輻射的雌性果蠅體內(nèi)MDA含量的影響Fig.3 Effect of Cordyceps militaris on MDA content in female Drosophila melanogaster after UV radiation

圖4 蛹蟲草對經(jīng)紫外輻射的雄性果蠅體內(nèi)MDA含量的影響Fig.4 Effect of Cordyceps militaris on MDA content in male Drosophila melanogaster after UV irradiation

如圖3、4所示，對雌、雄果蠅體內(nèi)的MDA含量進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)在輻射剛結(jié)束時，果蠅體內(nèi)的MDA含量隨著輻射時間的延長先下降后上升，在CK培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，輻射20 min的雌性果蠅體內(nèi)MDA含量上升3.14%，雄性果蠅體內(nèi)MDA含量上升3.04%，但與輻射后立即測定值相比差異均不顯著（P＞0.05）；在CK培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，輻射40 min的雌性果蠅體內(nèi)MDA含量上升6.82%，與輻射后立即測定值相比差異顯著（P＜0.05），雄性果蠅體內(nèi)MDA含量上升5.71%，與輻射后立即測定值相比差異不顯著（P＞0.05）。

如圖3a、4a所示，將未經(jīng)輻射的果蠅在不同質(zhì)量分數(shù)的蛹蟲草培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅰ時，10 d后果蠅體內(nèi)的MDA含量下降最少；當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅱ和Ⅲ時，10 d后果蠅體內(nèi)的MDA含量均下降，并且與輻射后立即測定值相比達差異極顯著水平（P＜0.01），其中在Ⅲ型培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后果蠅體內(nèi)MDA含量下降最多，雌性果蠅體內(nèi)MDA含量下降13.89%，雄性果蠅體內(nèi)MDA含量下降14.58%。由此可見，在未經(jīng)紫外輻射的情況下，蛹蟲草能夠降低果蠅體內(nèi)的MDA含量，其中Ⅲ型培養(yǎng)基效果最佳。

如圖3b、4b所示，將輻射20 min的果蠅在不同質(zhì)量分數(shù)的蛹蟲草培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10 d后果蠅體內(nèi)的MDA含量均下降，當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅱ和Ⅲ時，果蠅體內(nèi)的MDA含量均下降均達到極顯著水平（P＜0.01），其中以Ⅲ型培養(yǎng)基效果最明顯，雌性果蠅體內(nèi)MDA含量下降16.29%，雄性果蠅體內(nèi)MDA含量下降17.11%；如圖3c、4c所示，輻射40 min的果蠅培養(yǎng)10 d后體內(nèi)MDA含量均下降，當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅱ時，雄性果蠅體內(nèi)的MDA含量下降率達到極顯著水平（P＜0.01），為9.06%，雌性果蠅體內(nèi)MDA含量下降率達到顯著水平（P＜0.05），為6.83%；當(dāng)培養(yǎng)基類型為Ⅲ時，雌、雄果蠅體內(nèi)的MDA含量與輻射后立即測定值差異不顯著（P＞0.05）。

由此可見，蛹蟲草的加入降低了自由基對不飽和脂肪酸的氧化作用，對果蠅體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)起到一定的積極促進效用。同時發(fā)現(xiàn)，雄性果蠅體內(nèi)的MDA含量的下降率高于雌性果蠅。

3 討 論

前人已研究過紫外線對果蠅的影響，結(jié)果表明紫外輻射可誘使果蠅體內(nèi)自由基水平升高，隨輻射時間的延長，果蠅體內(nèi)MDA含量顯著升高[20]。本研究利用紫外線對果蠅分別照射20 min和40 min，結(jié)果表明隨著輻射時間的延長，果蠅體內(nèi)的SOD活性先上升后下降，MDA含量先下降后上升。將未經(jīng)紫外輻射的雌、雄果蠅培養(yǎng)在不同質(zhì)量分數(shù)的蛹蟲草培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型培養(yǎng)基提高果蠅體內(nèi)SOD活性的效果最佳，Ⅲ型培養(yǎng)基降低果蠅體內(nèi)MDA含量的效果最佳，可見蛹蟲草質(zhì)量分數(shù)的高低直接影響抗氧化的效果，適宜的蛹蟲草質(zhì)量分數(shù)才能達到對果蠅最佳的抗氧化保護作用。

本實驗研究了蛹蟲草對果蠅紫外輻射的抗氧化保護作用，認為蛹蟲草能顯著提高果蠅體內(nèi)的SOD活力，降低MDA含量。這和黑蒜[21]、烏雞黑色素[22]、酸棗提取物[23]和紫玉米色素[24]對果蠅的紫外輻射抗氧化保護作用結(jié)論相同。同時研究發(fā)現(xiàn)，對于短時間輻射，蛹蟲草的抗紫外輻射保護作用效果佳，而長時間的輻射會使得果蠅機體自身的抗氧化酶修復(fù)系統(tǒng)遭到嚴重破壞，蛹蟲草清除氧自由基的能力也相應(yīng)減弱。本實驗還分別對雌、雄果蠅進行了研究，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草對雄性果蠅的抗氧化保護作用優(yōu)于對雌性果蠅。由于實驗用蛹蟲草中蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素等物質(zhì)含量不等，今后還有待于將它們分別提純，以單一成分來研究其抗輻射效應(yīng)。本研究的成果為今后開發(fā)蛹蟲草功能性保健食品提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

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Protective Effect of Cordyceps militaris on UV-Induced Oxidative Damage in Drosophila melanogaster

HUANG Yaqin1,2, LI Jinzhe1,*, DUAN Hongbin1, YIN Donglin1
(1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Xinyang College of Agriculture and Forestry, Xinyang 464000, China; 2. Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bio-engineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)

In order to study the protective effect of Cordyceps militaris against ultraviolet radiation-induced oxidative damage in Drosophila melanogaster, fruit flies were radiated by UV and fed with Cordyceps militaris-supplemented medium at different concentrations. We found that 0.4% Cordyceps militaris powder added to the medium could significantly increase SOD activity (by up to 13.09%, P = 0.005 9) and decrease MDA content (by up to 17.11%, P = 0.003 2) in male fruit flies irradiated by UV for 20 min and that the same effects were obtained for fruit flies with 40 min UV radiation, when 0.2% Cordyceps militaris powder added to the medium, showing an 8.99% in increase SOD activity (P = 0.006 6) and a 9.06% decrease in MDA content (P = 0.006 1). The antioxidant protection of Cordyceps militaris on male fruit flies was better than on the female ones. Thus, the appropriate concentration of Cordyceps militaris powder was able to repair UV irradiation-induced oxidative damage and played an anti-UV radiation role in fruit flies.

Cordyceps militaris; ultraviolet radiation; Drosophila melanogaster; superoxide dismutase; malondialdehyde

S646.9

A

1002-6630（2015）21-0258-05

10.7506/spkx1002-6630-201521048

2015-01-08

河南省科技攻關(guān)計劃項目（132102110047）；信陽農(nóng)林學(xué)院青年基金項目（201401010）

黃雅琴（1986—），女，講師，博士研究生，研究方向為輻射生物學(xué)。E-mail：hyaqin88@163.com

*通信作者：李盡哲（1982—），男，講師，碩士，研究方向為生物制藥技術(shù)。E-mail：xynz1688@163.com