藍(lán)莓花青素氯化錦葵色素在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的抗氧化作用

徐麗萍，付 琳,，黃午陽，李春陽,*，朱運明

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

藍(lán)莓花青素氯化錦葵色素在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的抗氧化作用

徐麗萍1，付 琳1,2，黃午陽2，李春陽2,*，朱運明2

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

目的：研究氯化錦葵色素對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中活性氧（reactive oxygen species，ROS）和黃嘌呤氧化酶-1（xanthine oxidase-1，XO-1）含量的影響，探討氯化錦葵色素在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的抗氧化作用。方法：體外培養(yǎng)HUVEC，分別設(shè)定空白組（僅加入二甲基亞砜），血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）刺激組（10－2μmol/L），終濃度為1、5、10 μmol/L氯化錦葵色素組，以及終濃度為1、5、10 μmol/L氯化錦葵色素聯(lián)合AngⅡ刺激（10－2μmol/L）組。采用熒光免疫法測定HUVEC內(nèi)ROS含量的變化，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定細(xì)胞上清液中可溶性XO-1含量的變化，Western blotting法檢測細(xì)胞中XO-1含量的變化。結(jié)果：氯化錦葵色素處理HUVEC時，細(xì)胞ROS和XO-1含量降低；AngⅡ引起HUVEC內(nèi)ROS和上清液中XO-1含量顯著增加，各濃度氯化錦葵色素預(yù)處理能有效抑制ROS和XO-1含量的增加。結(jié)論：氯化錦葵色素在HUVEC中具有抑制ROS和XO-1的作用，從而達(dá)到抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功效。藍(lán)莓花青素氯化錦葵色素具有抑制ROS和XO-1的作用，為藍(lán)莓的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

藍(lán)莓；錦葵色素；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；活性氧；黃嘌呤氧化酶-1

隨著活性氧自由基研究的日趨深入，大量研究證明動脈粥樣硬化、心律失常、充血性心力衰竭、高血壓等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[1]。氧化應(yīng)激在慢性疾病，包括冠狀動脈心臟疾病、癌癥和老化的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是體內(nèi)氧化應(yīng)激的主要來源，ROS主要包括超氧陰離子自由基（·）、羥自由基（·OH）及過氧化氫（H2O2）等，是生物體內(nèi)隨代謝活動不斷產(chǎn)生的。正常情況下，低濃度的ROS能調(diào)節(jié)血管細(xì)胞的功能，對于機體血管維持正常功能是必需的，但是若ROS產(chǎn)生過多或不能迅速消除，則會造成人體組織細(xì)胞損傷[2-3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞參與產(chǎn)生的ROS有多種，如黃嘌呤氧化酶-1（xanthine oxidase-1，XO-1）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等[4-5]。XO-1是嘌呤分解代謝過程中一種很重要的酶，催化黃嘌呤形成尿酸以及次黃嘌呤形成黃嘌呤的氧化過程，反應(yīng)時會生成過氧化物，引起連鎖反應(yīng)[6-8]。XO-1已被證實在動脈粥樣硬化中是引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的過氧化物的主要來源[9-10]。內(nèi)皮細(xì)胞中XO-1含量的增加及其產(chǎn)生的超氧化物產(chǎn)物會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，從而引起冠心病、心血管等疾病[11-15]，而XO-1抑制劑可以用于治療相關(guān)疾病。

藍(lán)莓（Vaccinium spp.）屬于杜鵑花科越橘屬植物，是一種具有極高經(jīng)濟價值的世界性新興小漿果果樹。藍(lán)莓含有花青素等多種酚類活性物質(zhì)，使藍(lán)莓果實具有很強的抗氧化活性[16-19]?；ㄇ嗨乇蛔C明是人類歷史上最有效的天然抗氧化劑，有增強心臟功能、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌及抗突變等多種生理活性功能[20-25]。本課題組前期的研究[26-27]表明錦葵色素在兔眼藍(lán)莓（Vaccinium ashei）中是含量最高的花青素，并且具有良好的體外抗氧化活性和抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的作用。因此，本研究進(jìn)一步探討氯化錦葵色素（malvidin-Cl，Mv-Cl）在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）內(nèi)的抗氧化作用機制，檢測其對內(nèi)皮細(xì)胞ROS和XO-1產(chǎn)生的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 上海中喬新舟生物科技有限公司；氯化錦葵色素（Mv-Cl）、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ） 美國Sigma公司。

DMEM高糖培養(yǎng)液、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-胰酶、胎牛血清 美國Gibco公司；ROS檢測試劑盒、硝酸纖維素膜、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 碧云天生物技術(shù)有限公司；Western blotting及IP裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、XO-1一抗、β-actin一抗、辣根過氧化酶標(biāo)記兔二抗、辣根過氧化酶標(biāo)記鼠二抗 武漢博士德公司；XO-1酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海博谷生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Airtech超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國熱電公司；Berthold LB941微孔板式多功能分析儀 德國Berthold Technologies公司；電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；全自動電熱高壓力蒸汽鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TDZ5-WS水平離心機 上海滬湘儀器有限公司；3K15離心機 德國Sigma公司；IX53倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 HUVEC培養(yǎng)

取出液氮中保存的HUVEC，用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、2%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中復(fù)蘇細(xì)胞，再用0.25% EDTA-胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞計數(shù)、傳代、凍存。選擇生長良好的3～7 代細(xì)胞用于實驗。

1.3.2 Mv-Cl處理HUVEC

待細(xì)胞長至80%～90%融合時，進(jìn)行細(xì)胞消化制備成細(xì)胞懸液，取10 μL于血球計數(shù)板上計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL。

6 孔板培養(yǎng)HUVEC，設(shè)立以下分組：空白組（僅加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）），AngⅡ刺激組（10－2μmol/L），終濃度為1、5、10 μmol/L Mv-Cl組（分別命名為M1組、M5組、M10組），以及終濃度為1、5、10 μmol/L Mv-Cl聯(lián)合AngⅡ刺激（10－2μmol/L）組（分別命名為M1A組、M5A組、M10A組）。預(yù)先加入不同濃度的Mv-Cl處理18 h，加入或不加入AngⅡ再培養(yǎng)6 h，測定細(xì)胞各項指標(biāo)變化。

1.3.3 細(xì)胞活力測定

收集對數(shù)期HUVEC，制備細(xì)胞懸浮液，每孔100 μL接種于96 孔板中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，待長滿至孔底時，棄去培養(yǎng)液，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞處于同步生長狀態(tài)。加入不同濃度Mv-Cl刺激18 h，隨后加入AngⅡ刺激8 h。每孔加入5 mg/mL四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)液。每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶標(biāo)免疫檢測儀上于490 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值。同時設(shè)置空白組（只加入培養(yǎng)基、MTT、DMSO）重復(fù)3 次實驗，按照下式計算HUVEC的細(xì)胞活力。

1.3.4 熒光免疫法測定細(xì)胞中ROS水平

按照1.3.2節(jié)方法刺激HUVEC 24 h后，棄去上清液，在無菌條件下裝載2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）探針（終濃度10 μmol/L），37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清DMEM培養(yǎng)液或無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。在暗室中用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行熒光拍照觀察各組細(xì)胞中ROS水平，并用Berthold LB941熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長535 nm檢測熒光強度，以熒光強度值（arbitrary unit，a.u.）表示細(xì)胞中ROS水平（以β-actin為內(nèi)參）。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3.5 ELISA法測定細(xì)胞上清液中XO-1含量

HUVEC經(jīng)不同分組藥物刺激后，取細(xì)胞上清液，按一定比例稀釋，根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上于450 nm波長處測定OD值。

根據(jù)樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)的蛋白質(zhì)水平，乘以稀釋度計算樣品的最終蛋白質(zhì)水平，測定出樣品XO-1含量（以β-actin為內(nèi)參）。

1.3.6 Western blotting測定細(xì)胞中XO-1含量

棄去6 孔板中培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞得到蛋白樣品，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測XO-1含量。聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜進(jìn)行1.5 h濕轉(zhuǎn)，取膜37 ℃封閉、一抗孵育各1 h，TBST緩沖液（Tris-HCl緩沖液+吐溫）洗滌5 次，每次6 min，37 ℃二抗孵育1 h，TBST緩沖液洗滌，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，拍照，根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白XO-1的含量（以β-actin為內(nèi)參）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Mv-Cl對HUVEC的保護(hù)作用

圖1 不同濃度Mv-Cl對HUVEC細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of different Mv-Cl concentrations on HUVEC cell viability

由圖1可知，與空白組相比，AngⅡ刺激組HUVEC的細(xì)胞活力受到抑制，說明AngⅡ具有顯著的損傷細(xì)胞作用；當(dāng)使用1、10、50 μmol/L Mv-Cl與AngⅡ共同作用于HUVEC時，細(xì)胞活力相比AngⅡ刺激組極顯著升高（P＜0.01），說明Mv-Cl對HUVEC具有一定的保護(hù)作用。

2.2 Mv-Cl對HUVEC中ROS水平的影響

Mv-Cl單獨處理HUVEC時，細(xì)胞中超氧化物水平會降低。隨著Mv-Cl濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低（均小于空白組），1、5、10 μmol/L的Mv-Cl處理HUVEC后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別降低了4%、6%、11%。然而，1、5 μmol/L的Mv-Cl對HUVEC中ROS水平的影響不顯著。只有當(dāng)Mv-Cl濃度達(dá)到10 μmol/L時，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平才顯著降低（P＜0.001）（圖2）。圖3觀察結(jié)果同樣顯示M10組熒光強度大幅下降，即HUVEC內(nèi)的ROS水平明顯減少。這表明高濃度的Mv-Cl可以直接作用于HUVEC，抑制細(xì)胞中ROS的生成。

圖2 不同濃度Mv-Cl對HUVEC內(nèi)ROS水平的影響Fig.2 Effects of different Mv-Cl concentrations on ROS level in HUVECs

圖3 倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度Mv-Cl對HUVEC內(nèi)ROS水平的影響Fig.3 Effects of different Mv-Cl concentrations on ROS level in HUVECs as observed under inverted fluorescence microscope

AngⅡ（10?2μmol/L）刺激HUVEC后，內(nèi)皮細(xì)胞中超氧化物含量增加。用Mv-Cl預(yù)處理HUVEC，可以保護(hù)細(xì)胞減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS水平降低。隨著Mv-Cl濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)ROS含量減?。ň∮诳瞻捉M），1、5、10 μmol/L的Mv-Cl預(yù)處理HUVEC后，相對于AngⅡ刺激組，細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別降低了12%、18%、20%（P＜0.001）。由圖4、5可知，Mv-Cl對HUVEC中ROS水平的影響顯著，可以完全保護(hù)HUVEC免受AngⅡ引起的氧化應(yīng)激損傷，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 不同濃度Mv-Cl對AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC內(nèi)ROS水平的影響Fig.4 Effects of different Mv-Cl concentrations on Ang II-induced ROS level in HUVECs

圖5 倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度Mv-Cl對AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC內(nèi)ROS水平的影響Fig.5 Effects of different Mv-Cl concentrations on Ang II-induced ROS level in HUVECs as observed under inverted fluorescence microscope

2.3 Mv-Cl對HUVEC中XO-1含量的影響

由圖6可知，與空白組相比，使用Mv-Cl單獨處理HUVEC時，細(xì)胞上清液中XO-1含量降低（各Mv-Cl濃度組XO-1含量均小于空白組）。空白組HUVEC上清液中XO-1含量為（5.21±0.84） μg/L，1、5、10 μmol/L的Mv-Cl處理細(xì)胞后，上清液中XO-1含量分別為（3.53±0.04）、（3.95±0.43）、（4.79±0.26） μg/L，分別為空白組的0.68、0.76、0.92 倍，其中M1組與空白組相比差異顯著（P＜0.05）。

圖6 不同濃度Mv-Cl對HUVEC上清液中XO-1水平的影響Fig.6 Effect of different Mv-Cl concentrations on XO-1 level in culture supernatant of HUVECs

Western blotting測定HUVEC中XO-1含量變化也得到相似的結(jié)果。由圖7可知，空白組細(xì)胞的XO-1相對含量為0.69±0.03，1、5、10 μmol/L的Mv-Cl處理細(xì)胞后，XO-1相對含量分別為0.61±0.04（P＜0.05）、0.59±0.03（P＜0.01）、0.68±0.03，分別為空白組的0.88、0.86、0.98 倍。這表明低濃度Mv-Cl可以直接作用于HUVEC細(xì)胞，通過減少細(xì)胞中XO-1含量來降低細(xì)胞中過氧化物的水平，從而達(dá)到抗氧化的效果。Mv-Cl濃度過高反而會影響HUVEC細(xì)胞的生長，使抗氧化效果減弱。

圖7 不同濃度Mv-Cl對HUVEC中XO-1水平的影響Fig.7 Effects of different Mv-Cl concentrations on XO-1 level in culture supernatant of HUVECs

由圖8可知，AngⅡ（10－2μmol/L）刺激HUVEC后，內(nèi)皮細(xì)胞上清液中XO-1含量極顯著增加（P＜0.01）。使用Mv-Cl預(yù)處理HUVEC，可以保護(hù)細(xì)胞，顯著抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的XO-1水平升高。隨著Mv-Cl濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)XO-1水平先減小后增加，但均低于空白組?？瞻捉M的XO-1含量為（7.17±0.18） μg/L，AngⅡ刺激組的XO-1含量為（8.84±0.29） μg/L（為空白組的1.23 倍），1、5、10 μmol/L的Mv-Cl預(yù)處理細(xì)胞后，再加10－2μmol/L的AngⅡ刺激，細(xì)胞內(nèi)XO-1含量分別為（6.24±0.01）、（5.35±0.11）、（6.27±0.25） μg/L（P＜0.001），分別為空白組的0.87、0.75、0.88 倍。由此可以看出，Mv-Cl對HUVEC中XO-1水平的影響高度顯著，完全可以保護(hù)HUVEC免受AngⅡ引起的氧化損傷，顯著抑制XO-1水平升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。Mv-Cl對HUVEC中XO-1水平的影響也隨其濃度的升高先增強后減弱，在Mv-Cl濃度為5 μmol/L時，抗氧化活性最強。

圖8 不同濃度Mv-Cl對AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC中XO-1水平的影響Fig.8 Effects of different Mv-Cl concentrations on AngII-induced XO-1 level in culture supernatant of HUVECs

3 結(jié) 論

本實驗以HUVEC為研究對象，通過熒光免疫法、ELISA法及Western blotting法檢測了不同濃度的Mv-Cl對HUVEC及AngⅡ刺激（10－2μmol/L）后的HUVEC中ROS水平變化和XO-1表達(dá)量的影響，從分子水平上發(fā)現(xiàn)抗氧化物藍(lán)莓花青素Mv-Cl對內(nèi)皮細(xì)胞中ROS和XO-1表達(dá)具有顯著的抑制作用。藍(lán)莓花青素的抗氧化功能與抑制炎癥、保護(hù)心血管功能有關(guān)，本實驗結(jié)果表明Mv-Cl可抑制由AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS和XO-1過表達(dá)，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷。綜上所述，藍(lán)莓花青素Mv-Cl具有抗氧化作用，可作為一種潛在的XO-1抑制劑，對防治心血管疾病起到積極作用，為藍(lán)莓的開發(fā)利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1] GRIENDLING K K, FITZGERALD G A. Oxidative stress and cardiovascular injury part I: basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS[J]. Circulation, 2003, 108(16): 1912-1916.

[2] CALHOUN D A, JONES D, TEXTOR S, et al. Resistant hypertension: diagnosis, evaluation, and treatment a scientific statement from the American Heart Association Professional Education Committee of the Council for High Blood Pressure Research[J]. Hypertension, 2008, 51(6): 1403-1419.

[3] LENZ T L, MONAGHAN M S. Lifestyle modifications for patients with hypertension[J]. Journal of the American Pharmacists Association, 2008, 48: 92-102.

[4] KANTEMAN J, SADEFELDMAN M, BANIYASH M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression[J]. Seminars in Cancer Biology, 2012, 22(4): 307-318.

[5] AVRAM Z E, KRISHNAN E. Hyperuricaemia-where nephrology meets rheumatology[J]. Rheumatology, 2008, 47(7): 960-964.

[6] LANG D, MOSFER S I, SHAKESBY A, et al. Coronary microvascular endothelial cell redox state in left ventricular hypertrophy the role of angiotensin II[J]. Circulation Research, 2000, 86(4): 463-469.

[7] LANDMESSER U, SPIEKERMANN S, DIKALOV S, et al. Vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in patients with chronic heart failure role of xanthine oxidase and extracellular superoxide dismutase[J]. Circulation, 2002, 106(24): 3073-3078.

[8] NOMURA J, BUSSO N, IVES A, et al. Xanthine oxidase inhibition by febuxostat attenuates experimental atherosclerosis in mice[J]. Scientific Reports, 2013, 4: 4554.

[9] LANDMESSER U, SPIEKERMANN S, PREUSS C, et al. Angiotensin II induces endothelial xanthine oxidase activation role for endothelial dysfunction in patients with coronary disease[J]. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2007, 27(4): 943-948.

[10] SPIEKERMANN S, LANDMESSER U, DIKALOV S, et al. Electron spin resonance characterization of vascular xanthine and NAD(P)H oxidase activity in patients with coronary artery disease relation to endothelium-dependent vasodilation[J]. Circulation, 2003, 107(10): 1383-1389.

[11] OTTERBEIN L E, CHOI A M K. Heme oxygenase: colors of defense against cellular stress[J]. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, 2000, 279(6): 1029-1037.

[12] GROSSER N, OBERLE S, BERNDT G, et al. Antioxidant action of L-alanine: heme oxygenase-1 and ferritin as possible mediators[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 314(2): 351-355.

[13] POLTE T, ABATE A, DENNERY P A, et al. Heme oxygenase-1 is a cGMP-inducible endothelial protein and mediates the cytoprotective action of nitric oxide[J]. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2000, 20(5): 1209-1215.

[14] BELOVA L A. Angiotensin II-generating enzymes[J]. Biochemistry (Moscow), 2000, 65(12): 1337-1345.

[15] BRIONES A M, TOUYZ R M. Oxidative stress and hypertension: current concepts[J]. Current Hypertension Reports, 2010, 12(2): 135-142.

[16] ERDMANN K, GROSSER N, SCHIPPOREIT K, et al. The ACE inhibitory dipeptide Met-Tyr diminishes free radical formation in human endothelial cells via induction of heme-oxygenase-1 and ferritin[J]. Journal of Nutrition, 2006, 136(8): 2148-2152.

[17] CASTREJóN A D R, EICHHOLZ I, ROHN S, et al. Phenolic profile and antioxidant activity of highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.) during fruit maturation and ripening[J]. Food Chemistry, 2008, 109(3): 564-572.

[18] ZAFRA-STONE S, YASMIN T, BAGCHI M, et al. Berry anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease prevention[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2007, 51(6): 675-683.

[19] LAU F C, BIELINSKI D F, JOSEPH J A. Inhibitory effects of blueberry extract on the production of inflammatory mediators in lipopolysaccharide-activated BV2 microglia[J]. Journal of Neuroscience Research, 2007, 85(5): 1010-1017.

[20] de la SIERRA A, LARROUSSE M. Endothelial dysfunction is associated with increased levels of biomarkers in essential hypertension[J]. Journal of Human Hypertension, 2010, 24(6): 373-379.

[21] AQIL F, GUPTA A, MUNAGALA R, et al. Antioxidant and antiproliferative activities of anthocyanin/ellagitannin-enriched extracts from Syzygium cumini L.(jamun, the Indian blackberry)[J]. Nutrition and Cancer, 2012, 64(3): 428-438.

[22] MIGUEL M G. Anthocyanins: antioxidant and/or anti-inflammatory activities[J]. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2011, 1(6): 7-15.

[23] KALT W, MCDONALD J E, DONNER H. Anthocyanins, phenolics, and antioxidant capacity of processed lowbush blueberry products[J]. Journal of Food Science, 2000, 65(3): 390-393.

[24] BENVENUTI S, PELLATI F, MELEGARI M, et al. Polyphenols, anthocyanins, ascorbic acid, and radical scavenging activity of Rubus, Ribes, and Aronia[J]. Journal of Food Science, 2004, 69(3): 164-169.

[25] MCANULTY S R, MCANULTY L S, NIEMAN D C, et al. Consumption of blueberry polyphenols reduces exercise-induced oxidative stress compared to vitamin C[J]. Nutrition Research, 2004, 24(3): 209-221.

[26] HUANG W Y, WANG J, LIU Y M, et al. Inhibitory effect of malvidin on TNF-α-induced inflammatory response in endothelial cells[J]. European Journal of Pharmacology, 2014, 723: 67-72.

[27] LI C, FENG J, HUANG W Y, et al. Composition of polyphenols and antioxidant activity of rabbiteye blueberry (Vaccinium ashei) in Nanjing[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(3): 523-531.

Antioxidant Effect of Blueberry Malvidin Chloride in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

XU Liping1, FU Lin1,2, HUANG Wuyang2, LI Chunyang2,*, ZHU Yunming2
(1. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

Objective: The effect of malvidin chloride (Mv-Cl) extracted from blueberries on the amounts of reactive oxygen species (ROS) and xanthine oxidase-1 (XO-1) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was investigated to explore the antioxidant potential of the anthocyanin compound. Methods: HUVECs were in vitro cultured in the presence of Mv-Cl (1, 5 and 10 μmol/L), angiotensinⅡ(Ang II, 10-2μmol/L) and their combination, respectively. DMSO was used as control. The ROS content in the cells was detected by immunofluorescence. The soluble XO-1 protein content in the cell culture supernatant was detected by ELISA. The protein expression of XO-1 in the cells was assessed by Western blotting. Results: The content of ROS and the protein expression of XO-1 in HUVECs were decreased when treated with low concentration of Mv-Cl. Ang II significantly increased ROS and XO-1 content, and Mv-Cl appeared to specifically down-regulate the production of ROS and XO-1. Conclusion: Malvidin chloride can prevent endothelial dysfunction by inhibiting ROS and XO-1. Therefore, blueberry anthocyanin may be a new inhibitor of ROS and XO-1, which provides a theoretical basis for the application of blueberry anthocyanins to prevent cardiovascular diseases as a functional food or nutraceutical ingredient.

blueberry; malvidin; human umbilical vein endothelial cells; reactive oxygen species; xanthine oxidase-1

R329.25；R332

A

1002-6630（2015）21-0233-05

10.7506/spkx1002-6630-201521043

2014-12-01

2014年江蘇省基礎(chǔ)研究計劃（自然科學(xué)基金）面上研究項目（BK20141386）

徐麗萍（1963—），女，教授，碩士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：xuliping@126.com

*通信作者：李春陽（1966—），男，研究員，博士，研究方向為營養(yǎng)與活性物質(zhì)，農(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：lichunyang968@126.com