甲狀腺素T3對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠胰腺的保護作用

成向榮，丁寅翼，武 旭，夏淑芳，施用暉，樂國偉

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

甲狀腺素T3對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠胰腺的保護作用

成向榮，丁寅翼，武 旭，夏淑芳，施用暉，樂國偉

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

目的：研究甲狀腺素T3對四氧嘧啶（alloxan，ALX）誘導(dǎo)糖尿病小鼠胰腺損傷的預(yù)防和保護作用。方法：24 只雄性昆明小鼠隨機分成4 組，分別給予一次性腹腔注射生理鹽水、ALX、ALX和甲狀腺素T3、甲狀腺素T3，在注射后1、4、6、12、24 h各時間點測定小鼠血液活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，并在注射后28 d內(nèi)定期測定小鼠血糖水平變化。28 d后，處死小鼠，取出胰腺進行形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)指標(biāo)分析：檢測甲狀腺素T3對小鼠胰腺超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力以及還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量的影響，分析甲狀腺素T3對胰腺細胞抗氧化酶相關(guān)基因Nrf2、SOD、GSH-Px、CAT，細胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2表達的影響。結(jié)果：經(jīng)ALX誘導(dǎo)的小鼠血糖和血液ROS水平極顯著升高（P＜0.01），血液胰島素水平極顯著下降（P＜0.01），血液和胰腺抗氧化酶的活力均極顯著下降（P＜0.01）。此外，抗氧化酶相關(guān)基因以及細胞凋亡相關(guān)基因表達水平均出現(xiàn)了極顯著變化（P＜0.01）。注射甲狀腺素T3能夠改善由ALX引起的小鼠血糖水平上升和胰島素分泌不足，顯著或極顯著地緩解抗氧化酶活力下降及抗氧化相關(guān)基因表達下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），極顯著抑制Caspase-3、Caspase-9、Bax等促凋亡基因表達的升高（P＜0.01），促進抗凋亡基因Bcl-2的表達。結(jié)論：甲狀腺素T3能夠改善ALX誘導(dǎo)的糖尿病小鼠機體氧化還原狀態(tài)，調(diào)節(jié)胰腺細胞凋亡相關(guān)基因的表達水平，保護胰腺組織，避免胰腺出現(xiàn)β細胞凋亡的情況，從而維持和保護胰腺調(diào)節(jié)血糖水平的功能。

甲狀腺素T3；四氧嘧啶；糖尿??；胰腺

糖尿病已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的代謝性疾病，開發(fā)新型降血糖功能因子及功能食品是當(dāng)前研究熱點之一。多種生理、病理因子參與了糖尿病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，而糖尿病和機體氧化應(yīng)激之間的關(guān)系尤為密切。糖尿病患者的許多組織、器官都會受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的攻擊，并喪失部分的相關(guān)功能[1-2]。ROS可能直接或間接地來源于糖代謝紊亂，進而引起細胞結(jié)構(gòu)的損傷及功能的破壞，例如引發(fā)胰腺β細胞凋亡，導(dǎo)致胰腺分泌胰島素功能的喪失[3]。多種抗氧化功能因子，如白藜蘆醇、α-硫辛酸、槲皮素等能有效緩解氧化應(yīng)激對胰島β細胞的損傷作用[4-6]。

甲狀腺素T3調(diào)控哺乳動物的生長、發(fā)育，并參與絕大多數(shù)組織器官的代謝過程。目前，已有研究報道了甲狀腺素T3對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠胰腺β細胞的抗凋亡作用[7]。本課題組前期在過氧化氫誘導(dǎo)的HepG2細胞模型中發(fā)現(xiàn)甲狀腺素T3對氧化損傷的HepG2細胞具有明顯的保護作用，其抗氧化保護功能與提高抗氧化酶的活性及細胞內(nèi)抗氧化相關(guān)基因的表達水平有關(guān)。甲狀腺素T3能夠誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生低水平的ROS，從而激活某些轉(zhuǎn)錄因子，包括核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、激活蛋白-1（activated protein-1，AP-1）等，從而進一步激活下游的細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6等，最終促進抗氧化酶和抗凋亡基因的表達[8]。

胰腺是代謝系統(tǒng)中十分重要的腺體，其主要作用是分泌多種酶類和激素，參與代謝過程，其中包括促進糖代謝以供能。最近的研究表明，胰腺β細胞的凋亡以及氧化還原失衡可能是導(dǎo)致胰腺無法正常分泌足夠胰島素的兩個關(guān)鍵因素，從而導(dǎo)致了糖尿病的發(fā)生[1-2]。本研究旨在探究甲狀腺素T3是否能夠通過改善糖尿病小鼠機體及胰腺組織的氧化還原狀態(tài)，以及保護胰腺β細胞避免凋亡這兩個方面來改善糖尿病的病征，進而為開發(fā)預(yù)防和改善糖尿病的食品功能因子提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四氧嘧啶（alloxan，ALX）、甲狀腺素T3 北京百靈威科技有限公司；5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide，DMPO）（純度97%） 美國Sigma-Aldrich有限公司；血糖試紙 美國強生公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測試盒、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）測試盒南京建成生物工程研究所；Trizol試劑盒、SYBR反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse quantity real-time transcript polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒美國Applied Biosystems公司；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒廈門慧嘉生物技術(shù)有限公司；小鼠胰高血糖素ELISA試劑盒 上海美旋生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀 美國強生公司；EMXplus-10/12電子自旋共振譜儀（electron spin resonance，ESR） 德國Bruker公司；7900HT實時熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司；ASP200S自動組織脫水機、EG1150H石蠟包埋機、RM2245石蠟切片機 德國Leica公司。

1.3 動物

清潔級6 周齡健康雄性昆明小鼠24 只，體質(zhì)量（25±2） g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于江南大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境中無致病菌，光-暗周期為12 h，室溫控制（23±1） ℃，相對濕度55%～65%，小鼠食物為江蘇省協(xié)同生物工程有限責(zé)任公司提供的小鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲用純凈水，實驗期為28 d。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與處理

24 只雄性小鼠適應(yīng)性飼喂1 周后，隨機分為4 組，每組6 只，分別為正常對照組（CON組）、ALX注射組（ALX組）、ALX和甲狀腺素T3注射組（ALX+T3組）、甲狀腺素T3注射組（T3組），分別予以一次性腹腔注射生理鹽水、125 mg/kg ALX（以小鼠體質(zhì)量計，下同）、125 mg/kg ALX和3 mg/kg甲狀腺素T3、3 mg/kg甲狀腺素T3。腹腔注射后24 h內(nèi)，在0、1、4、6、12、24 h各時間點對小鼠尾部采血，測定血液ROS水平。注射28 d內(nèi)，每3 d通過尾部采血測定小鼠血糖水平。在28 d實驗期末，禁食10 h后，用乙醚麻醉小鼠，眼球取血，斷頸處死小鼠。全血用于生化指標(biāo)測定，胰腺用于形態(tài)學(xué)研究、基因表達水平以及抗氧化指標(biāo)的測定。

1.4.2 小鼠全血ROS水平測定

DMPO原液用超純水稀釋10 倍。取小鼠全血25 μL，加入20 μL已稀釋的DMPO用以測定血液ROS水平。ESR設(shè)定參數(shù)：中心磁場強度：3 480 G；磁場掃描寬度：100 G；掃描時間：25 s；接收增益：50 dB；模式放大：3 G；衰減：10 dB；微波功率：20 mW。以ESR信號中央峰的峰高表示ROS的水平。

1.4.3 小鼠血清和胰腺抗氧化酶活力的測定

小鼠眼球采血，血液置于肝素鈉抗凝管中，4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液得到血清。取一定量的胰腺，用生理鹽水制成質(zhì)量分數(shù)10%的勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液。按照試劑盒說明書方法測定小鼠血清T-AOC活力，胰腺GSH、GSSG含量及SOD、CAT、GSH-Px活力。

1.4.4 小鼠胰腺總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR

表1 qRT-PCR基因的引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

根據(jù)Trizol試劑盒說明書方法提取胰腺總RNA。通過測定A260nm/A280nm值（應(yīng)在1.8～2.0之間）檢測RNA純度及濃度。根據(jù)濃度取2 μg RNA，加入隨機引物和脫氧核糖核苷三磷酸各2 μL，用DEPC水補足體系至10 μL，70 ℃水浴5 min后，迅速冰浴冷卻；隨后加入5×RT Buffer 5 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑0.25 μL、200 U/μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、DEPC水9.25 μL。37 ℃水浴1.5 h，95 ℃水浴3 min，得到的cDNA于－20 ℃條件下保存。

應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測組織中相關(guān)基因mRNA的相對表達量。PCR板每孔加入組織cDNA樣品0.5 μL、上游引物和下游引物各0.4 μL、SYBR酶5 μL、滅菌雙蒸水3.7 μL，體系總體積為10 μL。所用組織內(nèi)參基因均為β-actin。基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成。引物序列見表1。qRT-PCR產(chǎn)物的特異性由熔解曲線評估。擴增條件：階段1：95 ℃，5 min；階段2：95 ℃，20 s；60 ℃，30 s；72 ℃，20 s，45 個循環(huán)；階段3：72 ℃，2 min。

1.4.5 小鼠胰腺形態(tài)學(xué)分析

小鼠胰腺用10 g/100 mL的多聚甲醛磷酸緩沖液固定，在組織自動脫水機中脫水，用石蠟包埋機進行石蠟包埋，在石蠟切片機上制成厚度為5 μm的連續(xù)切片。根據(jù)試劑盒說明書方法進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠空腹血糖及胰島素、胰高血糖素水平

注射ALX后，小鼠的血糖水平出現(xiàn)了顯著上升。在為期28 d的實驗期內(nèi)，CON組小鼠的血糖水平穩(wěn)定在4.49～4.69 mmol/L之間，而ALX組小鼠的血糖水平始終極顯著高于CON組（P＜0.01）；同時注射甲狀腺素T3后，能夠極顯著緩解由ALX引起的血糖水平上升現(xiàn)象（P＜0.01）；單獨注射甲狀腺素T3后3 d時，小鼠血糖水平極顯著低于CON組（P＜0.01），6 d后，小鼠血糖水平恢復(fù)至正常水平（圖1A）。28 d實驗周期結(jié)束后測定小鼠血液胰島素水平，顯示經(jīng)ALX給藥小鼠的胰島素水平由正常的（5.24±0.94） mU/L極顯著降低至（2.83±0.76） mU/L（P＜0.01），而ALT+T3組小鼠血液胰島素水平顯著高于ALX組，并恢復(fù)至CON組水平，T3組小鼠血液胰島素水平略高于CON組，但無顯著差異（P＞0.05）（圖1B）。注射給予ALX后，小鼠胰高血糖素水平從CON組的（390±24） pg/mL極顯著下降至（225±35） pg/mL（P＜0.01），而T3組小鼠胰高血糖素水平則升高至（450±30） pg/mL，同時給予ALX和T3，小鼠胰高血糖素則恢復(fù)至CON組水平（圖1C）。

圖1 各組小鼠血糖（A）及血清胰島素（B）、胰高血糖素（C）水平比較Fig.1 Comparison of blood glucose (A), plasma insulin (B) and glucagon (C) levels in mice from 4 groups

2.2 小鼠血液及胰腺氧化應(yīng)激水平

圖2 注射給藥后24 h內(nèi)小鼠血液ROS水平變化Fig.2 Time dependence of ALX and T3 on blood ROS level at 24 h after injection

注射給藥后，從小鼠尾部取血測定血液ROS水平，用ESR信號中間峰的峰高表示。如圖2所示，接受注射后，各組小鼠血液ROS水平均出現(xiàn)了上升，但是接受ALX注射的小鼠血液ROS水平上升程度顯著高于CON組，并在注射后4 h時出現(xiàn)最高值（P＜0.01），同時注射甲狀腺素T3能顯著降低ALX組小鼠在1、4、6 h時的血液ROS水平（P＜0.01或P＜0.05）。單獨注射甲狀腺素T3后，也出現(xiàn)了ROS水平上升的現(xiàn)象，并且在4 h時出現(xiàn)最高值（P＜0.01）。28 d實驗周期結(jié)束后，測定小鼠血清T-AOC活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALX處理能夠極顯著降低小鼠血液T-AOC活力（P＜0.01），而同時注射甲狀腺素T3能夠緩解ALX對于血清T-AOC活力的影響（圖3）。

圖3 實驗第28天各組小鼠血液T-AOC活力比較Fig.3 Comparison of blood T-AOC in mice from 4 groups mice on day 28

圖4 各組小鼠胰腺氧化應(yīng)激水平比較Fig.4 Oxidative stress status of pancreas from mice in 4 groups

對胰腺抗氧化酶活力的測定結(jié)果如圖4所示，ALX組小鼠的SOD、CAT、GSH-Px活力極顯著低于CON組（P＜0.01），T3組小鼠的抗氧化酶活力與CON組小鼠相比無顯著差異。注射甲狀腺素T3能夠緩解ALX對于小鼠抗氧化酶活力的下調(diào)作用，恢復(fù)SOD活力至CON組水平。

表2 各組小鼠胰腺GSH和GSSG水平及GSH/GSSG值比較Table 2 Effect of ALX and T3 on GSH/GSSG ratio in pancreas

如表2所示，單獨注射ALX對小鼠胰腺GSH水平無明顯影響，但可以極顯著升高GSSG水平，從而降低GSH/GSSG值（P＜0.01）。與CON組相比，單獨注射甲狀腺素T3能極顯著提高小鼠胰腺GSH和GSSG水平，升高GSH/GSSG值（P＜0.01）。ALX+T3組小鼠胰腺GSH和GSSG水平均極顯著高于CON組和ALX組，并極顯著地緩解了由注射ALX引起的小鼠胰腺GSH/GSSG水平下降（P＜0.01）。

2.3 小鼠胰腺抗氧化酶基因表達水平

采用qRT-PCR技術(shù)對各組小鼠胰腺抗氧化酶相關(guān)基因的水平進行了分析，結(jié)果如圖5所示。單獨注射ALX極顯著下調(diào)了小鼠胰腺Nrf2、GSH-Px-1、GSH-Px-4、CAT、MnSOD、Cu-ZnSOD基因的表達（P＜0.01）。單獨注射甲狀腺素T3后，與CON組相比，Nrf2、Cu-ZnSOD、GSH-Px-1、GSH-Px-4基因表達水平極顯著上調(diào)（P＜0.01），但對MnSOD、CAT的基因表達水平影響不大。在注射ALX的同時給予甲狀腺素T3，則能夠有效緩減ALX造成的小鼠胰腺抗氧化相關(guān)基因表達水平下降的現(xiàn)象，并恢復(fù)至CON組水平。

圖5 各組小鼠胰腺抗氧化酶相關(guān)基因表達水平比較Fig.5 Comparison of expression levels of antioxidant enzyme genes in pancreas

2.4 小鼠胰腺形態(tài)學(xué)分析

圖6 各組小鼠胰腺形態(tài)學(xué)比較（HE，×40）Fig.6 Effect of T3 on histopathological changes in pancreatic tissue (HE, × 40)

28 d實驗周期結(jié)束后，取各組小鼠的胰腺組織切片，經(jīng)HE染色后如圖6所示，與CON組相比，ALX組小鼠胰腺β細胞群的面積比明顯減小，且β細胞群呈現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)，同時注射甲狀腺素T3能夠緩解ALX對于胰腺β細胞的影響。與CON組相比，單獨注射甲狀腺素T3對于胰腺β細胞沒有顯著影響。

2.5 小鼠胰腺促/抗細胞凋亡基因表達水平

圖7 各組小鼠胰腺促凋亡（Caspase-3、Caspase-9、Bax）及抗凋亡（Bcl-2）基因水平的比較Fig.7 Comparison of expression levels of pro-apoptosis genes (Caspase-3, Caspase-9 and Bax) and anti-apoptosis gene (Bcl-2) in pancreas

進一步采用qRT-PCR技術(shù)分析各組小鼠胰腺促細胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-9、Bax和抗凋亡基因Bcl-2的表達水平，實驗結(jié)果如圖7所示。注射ALX后，能夠極顯著上調(diào)小鼠胰腺促凋亡基因Caspase-3、Caspase-9、Bax的表達水平（P＜0.01），并下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達水平（P＜0.01）。單獨注射甲狀腺素T3，能極顯著上調(diào)小鼠胰腺抗凋亡基因Bcl-2的表達水平（P＜0.01），但對促凋亡基因Caspase-3、Caspase-9、Bax的表達水平無顯著影響。與ALX組相比，ALX+T3組極顯著緩解了由ALX引起的小鼠胰腺促凋亡基因表達的上調(diào)（P＜0.01），并極顯著提高了抗凋亡基因的表達水平（P＜0.01）。

3 結(jié)論與討論

目前，糖尿病已成為繼心腦血管疾病和癌癥之后的第三大疾病，嚴(yán)重危害人類健康。胰腺β細胞凋亡以及氧化還原狀態(tài)紊亂，被認為可能是導(dǎo)致胰島素分泌相對或絕對不足，從而引發(fā)糖尿病的兩個關(guān)鍵因素[1-2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者中，出現(xiàn)了甲狀腺素分泌異常、血清中游離甲狀腺素T3水平下降、甲狀腺功能減退的亞臨床癥狀[9-11]。在2型糖尿病小鼠中，補充甲狀腺素T3能夠緩解糖尿病腎病，降低小鼠的蛋白尿發(fā)生率[12]。體外研究表明，甲狀腺素T3可以提高胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化和VAMP2的轉(zhuǎn)錄，促進3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的利用[13]。本研究從小鼠胰腺的氧化應(yīng)激和胰腺β細胞的凋亡這兩個角度來探究甲狀腺素T3對糖尿病的預(yù)防和緩解作用。

本實驗采用對小鼠腹腔注射ALX來誘導(dǎo)糖尿病。實驗結(jié)果表明，以ALX處理后，小鼠出現(xiàn)了血糖水平上升、胰島素水平下降的現(xiàn)象，實驗期末的小鼠胰腺切片分析結(jié)果顯示，注射ALX后，小鼠胰腺β細胞群的面積比明顯減小，導(dǎo)致機體胰島素水平不足，肝臟、肌肉的葡萄糖轉(zhuǎn)運出現(xiàn)阻礙，最終表現(xiàn)為高糖血癥[14]。此外，ALX組小鼠胰高血糖素水平也出現(xiàn)下降，表明ALX對胰島α細胞也具有損傷作用。本實驗中，單獨注射甲狀腺素T3的小鼠血糖水平略低于CON組，并且血液胰島素水平有一定的升高，表明甲狀腺素T3對于機體葡萄糖利用有一定的促進作用，而這可能是通過促進Akt磷酸化實現(xiàn)的[7]。給ALX+T3組小鼠同時注射甲狀腺素T3，能夠有效緩解高糖血癥和低胰島素血癥的現(xiàn)象，進一步表明甲狀腺素T3對小鼠糖尿病的緩解作用，這與前期文獻[7]報道的甲狀腺素T3緩解鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的小鼠糖代謝紊亂、保護胰腺功能的研究結(jié)果一致。

采用ALX誘導(dǎo)小鼠糖尿病的同時，小鼠血液、胰腺組織出現(xiàn)顯著的氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為ROS水平顯著升高，而抗氧化酶水平顯著下降，而ROS的攻擊也是導(dǎo)致細胞凋亡的因素之一[13]。甲狀腺素T3能夠通過提高機體抗氧化酶活力而增強清除自由基的能力[8,15]。在本實驗中，單獨注射甲狀腺素T3的小鼠抗氧化酶活力高于CON組，而給ALX+T3組小鼠同時注射甲狀腺素T3，緩解了由ALX引起的小鼠胰腺抗氧化酶活力下降的現(xiàn)象。Nrf2是調(diào)節(jié)Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，其活化后可調(diào)節(jié)一些重要抗氧化酶類的表達，可以保護機體免受ROS攻擊，其調(diào)控的下游靶基因包括HO-1、NQO1等Ⅱ相解毒酶基因，以及過氧化還原酶Prdx1、金屬硫蛋白MT1等抗氧化酶[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺素T3能夠顯著提升肝臟細胞核中Nrf2的表達水平，降低Nrf2在細胞質(zhì)中的水平，說明甲狀腺素T3能夠促進Nrf2由細胞質(zhì)向細胞核的遷移，并激活由Nrf2誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄作用，而Nrf2能夠通過激活下游抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄而加速對于ROS的清除，從而保護細胞[18-20]。在本實驗中，ALX+T3組及T3組小鼠胰腺的Nrf2基因均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，結(jié)合這兩組小鼠較高的血清T-AOC活力及胰腺SOD、CAT、GSH-Px活力，進一步證明了甲狀腺素T3能夠上調(diào)Nrf2相關(guān)的抗氧化系統(tǒng)，降低由ALX引起的ROS對于胰腺的損傷。此外，在高糖誘導(dǎo)的小鼠胰島素瘤RIN-m5F細胞中，研究T3對胰島β細胞的保護作用，也觀察到甲狀腺素T3可顯著下調(diào)GSK-3β及Keap-1 mRNA表達水平，增強Nrf2通路相關(guān)的抗氧化系統(tǒng)，提高細胞抗氧化能力[21]。

胰腺組織切片和小鼠胰腺促/抗凋亡基因分析結(jié)果表明，ALX組小鼠胰腺β細胞群面積顯著降低，胰腺β細胞出現(xiàn)了嚴(yán)重的凋亡現(xiàn)象，而這必然引起胰腺功能損傷，導(dǎo)致機體胰島素水平不足。已有研究表明甲狀腺素T3具有很好的細胞保護作用，能夠上調(diào)抗凋亡基因的表達水平，下調(diào)促凋亡基因的表達水平[22-23]。在高糖誘導(dǎo)的RIN-m5F細胞中，發(fā)現(xiàn)甲狀腺素T3能顯著提高線粒體膜電位，上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2 mRNA表達水平，下調(diào)凋亡因子Bax基因表達水平，對抗細胞凋亡[21]。本研究結(jié)果也證實了這一點，甲狀腺素T3能夠通過調(diào)節(jié)促/抗凋亡基因的水平，維持胰腺在ALX誘導(dǎo)條件下的正常生理功能。

本實驗采用腹腔注射ALX誘導(dǎo)產(chǎn)生1型糖尿病小鼠模型，探究甲狀腺素T3在1型糖尿病模型中對小鼠胰腺的保護作用。實驗結(jié)果表明，甲狀腺素T3能夠改善糖尿病小鼠血糖水平過高以及胰島素分泌不足的現(xiàn)象。T3能夠通過改善機體和胰腺氧化還原狀態(tài)，提高抗氧化酶基因的表達水平及抗氧化酶活力，提高機體的ROS清除能力，從而保護胰腺，維持胰腺正常生理功能。此外，T3能夠通過調(diào)節(jié)與細胞凋亡相關(guān)的基因，改善糖尿病小鼠胰腺細胞凋亡的現(xiàn)象。綜合上述實驗結(jié)果，可得出以下結(jié)論：甲狀腺素T3可以作為一種胰島β細胞保護劑或抗氧化劑，而相應(yīng)地，一些能夠促進機體甲狀腺素T3合成、分泌的食品功能因子有應(yīng)用于糖尿病的預(yù)防和治療的潛力。

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Thyroid Hormone T3 Counteracts Pancreastic Dysfunction in Alloxan-Induced Diabetic Mice

CHENG Xiangrong, DING Yinyi, WU Xu, XIA Shufang, SHI Yonghui, LE Guowei
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Objective: The protective effects of thyroid hormone T3 on the dysfunction of pancreas in alloxan (ALX)-induced diabetic mice were investigated in this study. Methods: Twenty-four Kunming mice were randomly divided into four groups, including negative control group, ALX group, ALX plus T3 (ALX + T3) group, and T3 group, which were subjected to intraperitoneal administration of normal saline, ALX, ALX plus T3, and T3, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) in blood were tested at 1, 4, 6, 12, and 24 h after injection. Blood glucose was tested every 3 days. Mice were sacrificed at 28 days after injection. Whole pancreas and plasma were utilized for morphological and biochemical analyses. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px), the contents of reduced and oxidative glutathione (GSH and GSSG), the expression levels of antioxidant enzyme genes including Nrf2, SOD, GSH-Px, and CAT, and the expression levels of the apoptosis-associated genes Caspase-3, Caspase-9, Bax, Bcl-2 were examined in each group. Results: ALX induced a high level of blood glucose and ROS (P ＜ 0.01), low level of insulin in plasma (P ＜ 0.01), and lower activities of antioxidant enzymes in plasma and pancreas (P ＜ 0.01), as well as down-regulation of the antioxidant enzyme genes and apoptosis-related genes (P ＜ 0.01). T3 could ameliorate the enhancement of blood glucose and defective insulin secretion. The redox imbalance caused by ALX, including the decrease of antioxidant enzyme activities and gene expression levels, was counteracted by T3. Moreover, the up-regulated pro-apoptosis genes (Caspase-3, Caspase-9 and Bax) and down-regulated anti-apoptosis Bcl-2 gene were counteracted by T3 remarkably (P ＜ 0.01). Conclusion: T3 couldimprove the redox status of ALX-induced diabetic mice and protect pancreatic β-cells from cell death to maintain normal physiological function of pancreas.

thyroid hormone T3; alloxan; diabetes; pancreas

TS201.4

A

1002-6630（2015）21-0207-07

10.7506/spkx1002-6630-201521039

2015-06-23

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B05）

成向榮（1985—），男，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與功能因子。E-mail：cheng-xiangrong@hotmail.com