不同培養(yǎng)條件對(duì)禾谷鐮刀菌產(chǎn)玉米赤霉烯酮的影響

甄玉萍，裴世春，高建偉，王 巖，蔣媛媛

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

不同培養(yǎng)條件對(duì)禾谷鐮刀菌產(chǎn)玉米赤霉烯酮的影響

甄玉萍，裴世春*，高建偉，王 巖，蔣媛媛

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

研究不同培養(yǎng)條件對(duì)禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）產(chǎn)玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）能力的影響。選取不同的培養(yǎng)基配比、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速及光暗反應(yīng)對(duì)禾谷鐮刀菌進(jìn)行培養(yǎng)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明：禾谷鐮刀菌的最適培養(yǎng)基為每升超純水含葡萄糖60 g、KNO31.5 g、酵母浸出膏1.0 g、蛋白胨20 g、NaNO36.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KCl 0.5 g、Fe2(SO4)30.025 g；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為92 r/min、照明時(shí)間為10 h/d、培養(yǎng)溫度為22.9 ℃時(shí)，20 d毒素質(zhì)量濃度可達(dá)到249.80 μg/L。

禾谷鐮刀菌；玉米赤霉烯酮；酶聯(lián)免疫吸附分析法；真菌毒素

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是禾本科作物的重要病原菌之一[1-3]，中國(guó)北方地區(qū)的谷物均受到其不同程度的污染[4-7]。同時(shí)，禾谷鐮刀菌在侵染過程中會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體和動(dòng)物有害的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等真菌毒素[8-9]?，F(xiàn)今國(guó)內(nèi)外諸多研究者都在致力于玉米赤霉烯酮的檢測(cè)及其在生物和化學(xué)領(lǐng)域脫毒及拮抗性的研究[10-11]，使得該毒素的需求越來越大。但現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)沒有專門生產(chǎn)高純度玉米赤霉烯酮毒素的機(jī)構(gòu)，國(guó)內(nèi)研究者所使用的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品多數(shù)來自國(guó)外進(jìn)口，不僅購(gòu)買價(jià)格昂貴，而且進(jìn)口程序復(fù)雜，這為國(guó)內(nèi)真菌毒素研究帶來諸多不便。因此，為了促進(jìn)玉米赤霉烯酮生產(chǎn)的國(guó)產(chǎn)化進(jìn)程，有必要開展不同培養(yǎng)條件對(duì)禾谷鐮刀菌產(chǎn)玉米赤霉烯酮能力的影響研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖、K2HPO4·3H2O、蛋白胨、NaNO3、酵母浸出膏、Fe2(SO4)3、KCl、MgSO4均為分析純 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；110250 5B-05-3-3禾谷鐮刀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Fusarium boothii） 荷蘭漢福生物科技公司；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品、吐溫-20、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB） 美國(guó)Sigma公司；玉米赤烯酮BSA抗原 北京中科匯文遺傳技術(shù)發(fā)展中心；山羊抗小鼠IgG/辣根酶標(biāo)記 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗玉米赤霉烯酮抗體 實(shí)驗(yàn)室自行制備。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-Q全溫振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；ZHJH-C1109B超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；VICTOR X4多功能酶標(biāo)儀、Wahser400 96孔洗板機(jī) 美國(guó)GE公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MILLIPOREPEFERENCE超純水系統(tǒng) 美國(guó)密理博公司；FA1004N電子天平 上海菁海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ZEN的添加回收率及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法的檢出限

隨機(jī)抽取10 個(gè)新配制的液體培養(yǎng)基，將每個(gè)培養(yǎng)基平均分為3 份，在每組培養(yǎng)基中分別添加1 mL標(biāo)準(zhǔn)ZEN溶液，質(zhì)量濃度為5、50、500 μg/L，分別采用ELISA方法[12]和超高壓液相色譜質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）法[13-18]進(jìn)行檢測(cè)，多次重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。對(duì)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)限及靈敏度的分析[19]：計(jì)算10 個(gè)陰性孔OD450nm的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），以±s從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到該相應(yīng)值的最低濃度，即為方法的檢測(cè)限（limit of detection，LOD）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍確定定量限（limit of quantity，LOQ），并確定該方法的線性相關(guān)性。

1.3.2 菌株活化及液體培養(yǎng)

對(duì)菌種進(jìn)行2 次活化，第1次活化是從購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)品中挑取菌絲放入制備好的PDA平板培養(yǎng)基內(nèi)；第2次活化是從該平板培養(yǎng)基內(nèi)挑取小塊菌絲放入下一個(gè)制備好的PDA平板培養(yǎng)基中央，再放入25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用直徑為2 cm的打孔器取1 個(gè)活化菌種的外圈菌餅，接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基內(nèi)，塞好棉塞，用牛皮紙包扎好后放入搖床進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 液體培養(yǎng)基配方篩選

1.3.3.1 液體培養(yǎng)基配方的單因素試驗(yàn)

綜合相關(guān)文獻(xiàn)中的多種液體培養(yǎng)基配方[20-23]，以培養(yǎng)基成分中的葡萄糖、KNO3、酵母浸出膏、蛋白胨、NaNO3的質(zhì)量濃度為單因素自變量，以ZEN的產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組單因素試驗(yàn)水平重復(fù)進(jìn)行3 次。以葡萄糖30 g/L、KNO33.0 g/L、酵母浸出膏2.0 g/L、蛋白胨10 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO40.5 g/L、K2HPO4·3H2O 1.0 g/L、KCl 0.5 g/L、Fe2(SO4)30.025 g/L、1.0 L超純水為基準(zhǔn)，培養(yǎng)時(shí)間為4 d，分別考察葡萄糖為0、10、20、30、40 g/L，KNO3為0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L，酵母浸出膏為0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L，蛋白胨為0、10、15、20、25 g/L，NaNO3為0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L時(shí)對(duì)ZEN產(chǎn)量的影響。

1.3.3.2 液體培養(yǎng)基配方的正交試驗(yàn)

綜合以上單因素試驗(yàn)，確定了培養(yǎng)基的主要成分，根據(jù)確定的因素和水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.3.4 培養(yǎng)條件的確立

1.3.4.1 產(chǎn)ZEN培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)

通過結(jié)合文獻(xiàn)[24-26]，確定以照明時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速為單因素變量，以ZEN的產(chǎn)出量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組單因素試驗(yàn)水平重復(fù)進(jìn)行3 次，以白熾燈照明時(shí)間12 h/d、培養(yǎng)時(shí)間15 d、培養(yǎng)溫度25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速90 r/min為基準(zhǔn)，分別考察白熾燈照明時(shí)間為0、3、6、12、24 h，培養(yǎng)時(shí)間為3、6、12、24、48 d，培養(yǎng)溫度為5、10、20、30、40 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為0、30、60、90、120 r/min時(shí)對(duì)ZEN產(chǎn)量的影響。將培養(yǎng)液于1 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行ZEN產(chǎn)量的測(cè)定。

1.3.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化生產(chǎn)ZEN的培養(yǎng)條件

綜合以上所做的單因素試驗(yàn)，選取培養(yǎng)中最主要的幾個(gè)外界因素為自變量，以ZEN的產(chǎn)出量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken[27-29]設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面曲面分析試驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體培養(yǎng)基中ZEN的添加回收率及ELISA方法的檢出限

表1 玉米赤霉烯酮添加回收率Table 1 Spiked recovery of ZEN

通過在液體培養(yǎng)基中添加不同水平的毒素用ELISA和UPLC兩種檢測(cè)方法進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。當(dāng)添加水平為5、50 μg/L時(shí)，兩種檢測(cè)方法無顯著性差異，故僅對(duì)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，其LOD為0.01 μg/L，LOQ為0.1 μg/L，線性回歸方程為y = －0.544 8x +1.896 6（相關(guān)系數(shù)R2＝0.920 9），因R2＞0.9，可說明ZEN質(zhì)量濃度在0.01～10 μg/L范圍內(nèi)與OD450nm值之間具有很強(qiáng)的線性相關(guān)性，表明通過ELISA方法來進(jìn)行菌液中ZEN產(chǎn)量的檢測(cè)是可行的。

2.2 產(chǎn)ZEN培養(yǎng)基配方的單因素試驗(yàn)

圖1 培養(yǎng)基各單因素對(duì)ZEN產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of culture medium components on the yield of ZEN

由圖1a可知，隨著葡萄糖添加量的增加，ZEN的產(chǎn)量逐漸上升，當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到30 g/L以后，ZEN產(chǎn)量仍增加，但整體趨勢(shì)平緩，差異不顯著（P＞0.05）。由圖1b可知，隨著KNO3添加量的增加，ZEN的產(chǎn)量逐漸上升，當(dāng)KNO3添加量達(dá)到3.0 g/L以后，整體趨勢(shì)平緩，差異不顯著（P＞0.05）。由圖1c可知，隨著酵母浸出膏添加量的增加，ZEN的產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酵母浸出膏添加量達(dá)到3.0 g/L以后，ZEN產(chǎn)量仍有增加的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。由圖1d可知，隨著蛋白胨添加量的增加，ZEN的產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿窟_(dá)到20 g/L以后，ZEN產(chǎn)量變化趨于平緩，差異不顯著（P＞0.05）。由圖1e可知，隨著NaNO3添加量的增加，ZEN的產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)NaNO3添加量達(dá)到3.0 g/L以后，ZEN產(chǎn)量仍增加，但整體趨勢(shì)平緩，差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 產(chǎn)ZEN最佳培養(yǎng)基配方的正交試驗(yàn)及結(jié)果

通過結(jié)合文獻(xiàn)[20-23]以及前面所做的單因素試驗(yàn)得出葡萄糖、KNO3、酵母浸出膏、蛋白胨、NaNO3的添加量為主要培養(yǎng)基配方，固定其他培養(yǎng)基成分，對(duì)5 種因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表2所示。

表2 培養(yǎng)基配方的正交試驗(yàn)L16(45)結(jié)果Table2 L16(45) Orthogonal array design with experimental results for optimization of culture medium components

根據(jù)表2極差R的大小進(jìn)行因素的主次排列，5 個(gè)影響因素的主次順序是：A（葡萄糖添加量）＞D（蛋白胨添加量）＞B（KNO3添加量）＞C（酵母浸出膏添加量）＞E（NaNO3添加量）。

從試驗(yàn)的綜合衡量指標(biāo)ZEN產(chǎn)量及各水平的平均值ki可直觀看出，培養(yǎng)基配方的最優(yōu)水平組合為A4B2C2D4E4，即葡萄糖添加量為60 g/L、KNO3添加量為1.5 g/L、酵母浸出膏添加量為1.0 g/L、蛋白胨添加量為20 g/L、NaNO3添加量為6.0 g/L。

2.4 產(chǎn)ZEN培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)

圖2 各單因素培養(yǎng)條件對(duì)ZEN產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of culture conditions on the yield of ZEN

由圖2a可知，隨著每天照明時(shí)間的延長(zhǎng)，ZEN的產(chǎn)量逐漸升高，當(dāng)照明時(shí)間達(dá)到12 h以后，ZEN產(chǎn)量有所下降，說明12 h為可參考的照明時(shí)間。由圖2b可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)，ZEN的產(chǎn)量迅速升高，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到24 d以后，ZEN產(chǎn)量的趨勢(shì)保持不變，說明24 d左右為可參考的培養(yǎng)時(shí)間。由圖2c可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，ZEN的產(chǎn)量先升高后下降，溫度超過30 ℃后，可明顯看出，液體培養(yǎng)基中的菌絲逐漸停止生長(zhǎng)，由此可說明20 ℃左右為可參考的培養(yǎng)溫度。由圖2d可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的加快，ZEN的產(chǎn)量逐漸升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為90 r/min時(shí)，ZEN產(chǎn)量達(dá)到最大值，其后有下降的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05），說明90 r/min左右為可參考的搖床轉(zhuǎn)速。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化生產(chǎn)ZEN的培養(yǎng)條件

2.5.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)

通過結(jié)合文獻(xiàn)[24-26]以及前面所做的單因素試驗(yàn)得出影響禾谷鐮刀菌產(chǎn)ZEN的主要外界條件為照明時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速，因此本實(shí)驗(yàn)以照明時(shí)間（X1）、培養(yǎng)時(shí)間（X2）、培養(yǎng)溫度（X3）、搖床轉(zhuǎn)速（X4）為自變量，以菌液中測(cè)得的ZEN含量為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis for optimization of culture conditions

2.5.2 模型建立與方差分析

根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert v8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得主要分析結(jié)果如表4所示。

對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到如下方程：

Y＝235.68+10.01X1+68.42X2－19.81X3+7.68X4+ 3.36X1X2－1.87X1X3－2.83X1X4－18.23X2X3+6.43X2X4+

因素X2、X3、、、、對(duì)ZEN產(chǎn)量效果的線性效應(yīng)極顯著，因素X1、X2X3對(duì)ZEN產(chǎn)量效果的線性效應(yīng)顯著，因素X4、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4對(duì)ZEN產(chǎn)量效果的線性效應(yīng)不顯著。

比較影響ZEN產(chǎn)量顯著程度大小的各因素可知，其影響程度由大到小依次為培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、照明時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速，模型的回歸值F＝46.888＞F0.01（14,4）＝14.24，P＜0.000 1，表明該模型極顯著；相關(guān)系數(shù)R2＝0.979 1，調(diào)整R2＝0.958 2，說明該模型能解釋95.82%響應(yīng)值的變化，因而表明該模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好，可以用此模型對(duì)影響ZEN產(chǎn)量的培養(yǎng)條件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

表4 回歸方程方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of regression equation

2.5.3 響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

圖3 培養(yǎng)時(shí)間與溫度及其交互作用對(duì)ZEN產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of culture time and temperature on the yield of ZEN

由圖3可知，響應(yīng)曲面的坡度陡峭，表明ZEN產(chǎn)量對(duì)培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)溫度的變化敏感。固定每天照明時(shí)間為12 h，搖床轉(zhuǎn)速90 r/min，當(dāng)培養(yǎng)溫度處于較低和較高水平時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ZEN產(chǎn)量呈先升高后趨于平緩下降的趨勢(shì)；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間處于較低水平時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，ZEN產(chǎn)量先升高后下降，且變化較大。從等高線可看出對(duì)ZEN產(chǎn)量的影響，培養(yǎng)時(shí)間大于培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間與溫度之間的交互作用顯著，與表4中交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致。

圖4 照明時(shí)間與培養(yǎng)溫度及其交互作用對(duì)ZEN產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of light irradiation time and culture temperature on the yield of ZEN

由圖4可知，響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭，表明ZEN產(chǎn)量對(duì)照明時(shí)間與培養(yǎng)溫度的變化較為敏感。固定培養(yǎng)時(shí)間為16 d，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min，在照明時(shí)間不變的條件下，隨著培養(yǎng)溫度的逐漸升高，ZEN產(chǎn)量先升高后下降，且趨勢(shì)緩慢；在培養(yǎng)溫度不變的條件下，隨著照明時(shí)間的逐漸加長(zhǎng)，ZEN產(chǎn)量先升高后下降。從等高線可看出二者之間對(duì)ZEN產(chǎn)量的影響，培養(yǎng)溫度大于照明時(shí)間，與表4分析中影響ZEN產(chǎn)量顯著程度大小的各因素分析結(jié)果一致。

由圖5可知，響應(yīng)曲面的坡度略為陡峭，表明ZEN產(chǎn)量對(duì)照明時(shí)間與搖床轉(zhuǎn)速的變化略為敏感。固定培養(yǎng)時(shí)間為16 d，培養(yǎng)溫度為25 ℃，在照明時(shí)間不變的條件下，隨著搖床轉(zhuǎn)速的逐漸加快，ZEN產(chǎn)量呈先升高后下降的變化趨勢(shì)；在搖床轉(zhuǎn)速不變的條件下，隨著照明時(shí)間的逐漸加長(zhǎng)，ZEN產(chǎn)量先升高后下降。從等高線可看出二者之間對(duì)ZEN產(chǎn)量的影響，照明時(shí)間大于搖床轉(zhuǎn)速，與表4分析中影響ZEN產(chǎn)量顯著程度大小的各因素分析結(jié)果一致。等高線略偏圓形，表明兩因素之間的交互作用強(qiáng)度較弱，影響不顯著。

圖5 照明時(shí)間與搖床轉(zhuǎn)速及其交互作用對(duì)ZEN產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of light irradiation time and shaking speed on the yield of ZEN

通過模型優(yōu)化得出ZEN生產(chǎn)的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：照明時(shí)間每天9.58 h、培養(yǎng)時(shí)間20.38 d、培養(yǎng)溫度22.85 ℃、搖床轉(zhuǎn)速91.71 r/min，在此條件下ZEN的產(chǎn)量為244.97 μg/L。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)正交試驗(yàn)與響應(yīng)面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件進(jìn)行禾谷鐮刀菌在液態(tài)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，并在該優(yōu)化條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的情況，將條件參數(shù)修正為培養(yǎng)溫度22.9 ℃、培養(yǎng)時(shí)間20 d、照明時(shí)間10 h/d、搖床轉(zhuǎn)速92 r/min。培養(yǎng)基配方為每升超純水中含葡萄糖60 g、KNO31.5 g、酵母浸出膏1.0 g、蛋白胨20 g、NaNO36.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KCl 0.5 g、Fe2(SO4)30.025 g，得到ZEN產(chǎn)量可達(dá)到249.80 μg/L，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在1.93%左右。因此，正交試驗(yàn)法與響應(yīng)面法結(jié)合所得的產(chǎn)ZEN條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫方法與液-質(zhì)聯(lián)用的方法同時(shí)進(jìn)行菌液中標(biāo)準(zhǔn)毒素的添加回收實(shí)驗(yàn)，通過比較分析，兩者之間的添加回收率無顯著性差異，考慮到ELISA檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便，且靈敏度高，因此，ELISA方法可適用于菌液中ZEN毒素的檢測(cè)。結(jié)合正交試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)分析了不同培養(yǎng)條件下液體培養(yǎng)基中禾谷鐮刀菌產(chǎn)玉米赤霉烯酮的能力，篩選出了最佳的培養(yǎng)基配方和最優(yōu)的培養(yǎng)條件為每升超純水含葡萄糖60 g、KNO31.5 g、酵母浸出膏1.0 g、蛋白胨20 g、NaNO36.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KCl 0.5 g、Fe2(SO4)30.025 g，培養(yǎng)溫度22.9 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為20 d、照明時(shí)間為10 h/d、搖床轉(zhuǎn)速92 r/min，所得液體培養(yǎng)基中ZEN的產(chǎn)量可達(dá)249.80 μg/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為ZEN的國(guó)產(chǎn)化研究提供了一定的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Different Culture Conditions on the Production of Zearalenone by Fusarium graminearum

ZHEN Yuping, PEI Shichun*, GAO Jianwei, WANG Yan, JIANG Yuanyuan
(College of Food and Biological Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)

In the present study, the effects of different incubation conditions on the production of zearalenone (ZEN) by Fusarium graminearum were explored. Culture medium, incubation time, incubation temperature, shaking speed and light irradiation time were selected as important parameters affecting ZEN production. Single factor method was used in combination with orthogonal array design and response surface methodology to optimize the medium composition and culture conditions employing statistical analysis, respectively. The results showed that the optimal culture medium for Fusarium graminearum was comprised of 60 g/L C6H12O6, 1.5 g/L KNO, 1.0 g/L yeast extract paste, 20 g/L peptone, 6.0 g/L NaNO3, 0.5 g/L MgSO4, 1.0 g/L K2HPO4·3H2O, 0.5 g/L KCl, and 0.025 g/L Fe2(SO4)3in 1.0 L of ultrapure water. The concentration of ZEN was 249.80 μg/L when the cultivation was carried out for 20 days with a shaking speed of 92 r/min, 22.9 ℃ under light irradiation for 10 h a day.

Fusarium graminearum; zearalenone; enzyme-linked immunosorbent assay; mycotoxin

R446.61

A

1002-6630（2015）21-0168-07

10.7506/spkx1002-6630-201521032

2015-06-29

齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2014-015X）；國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2013FY113400）；

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12541871）

甄玉萍（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：15146694340@139.com

*通信作者：裴世春（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：peishichun@qqhru.edu.cn