酶法降解壇紫菜多糖及其產物分析

韓莎莎，黃臻穎，沈照鵬，程 曉，王 鵬，江曉路,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.中國海洋大學醫(yī)藥學院，山東 青島 266003）

酶法降解壇紫菜多糖及其產物分析

韓莎莎1，黃臻穎1，沈照鵬2，程 曉1，王 鵬1，江曉路1,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.中國海洋大學醫(yī)藥學院，山東 青島 266003）

以單因素試驗為基礎，通過正交試驗確定了壇紫菜多糖的最佳酶解工藝條件為：酶解溫度40 ℃、ph 6.0、酶解時間3 h。在此條件下，壇紫菜多糖酶解后的還原糖質量濃度為（1.42±0.12）mg/mL。利用液相色譜和質譜技術對酶解產物進行了組分分析和抗氧化活性檢測。結果表明：酶解產物S1和S2均以半乳糖為主，半乳糖在兩樣品中分別占93.0%、90.5%，S1和S2的單糖組成相差不大。S1和S2都具有抗氧化活性，尤其對·Oh的清除作用明顯，且抗氧化活性大小S1＞S2。聚合度在10～16內的偶數(shù)糖比聚合度為4～6的壇紫菜寡糖清除·Oh和O2－·的能力好，說明酶解產物的抗氧化活性與其聚合度有關，只有處于特定聚合度范圍內才具有明顯的抗氧化活性。

壇紫菜多糖；正交試驗；組分分析；聚合度；抗氧化活性

我國是世界上紫菜第一大生產國和出口國。目前市售紫菜主要以養(yǎng)殖紫菜為主，其中壇紫菜（Porphyra haitanensis）占我國養(yǎng)殖紫菜總量的80%以上[1]，主要產于福建、浙江等長江以南地區(qū)。目前紫菜主要應用于食品領域，加工方式簡單，營養(yǎng)成分難以發(fā)揮功能，造成了海洋資源的巨大浪費，因此開發(fā)新的加工方式，增加紫菜的附加值成為海洋經(jīng)濟時代的重要課題。已有的研究表明壇紫菜的主要成分為蛋白質（占干質量的34.48%～37.21%）和多糖（占干質量的20%～40%），同時還含有少量的脂肪（0.5%～2.09%）、無機鹽、維生素等[2]。紫菜不僅具有食用價值，同時還具有重要的藥用價值[3]。壇紫菜多糖（porphyran）具有抗氧化、免疫調節(jié)、抗腫瘤等活性[4-6]，它是由半乳糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖等構成的含硫酸基的大分子多糖[7]，由于其黏度高、水溶性低、不易被吸收，且直接注射對機體毒性大[8]，使得其在醫(yī)藥保健品等領域的應用受到限制。研究發(fā)現(xiàn)通過物理化學等方法將紫菜多糖降解為分子質量較低的紫菜寡糖，增加其溶解性，可大大提高其使用價值和應用范圍[9]。

海藻寡糖因其良好的溶解性、抗氧化、抗腫瘤等活性，逐漸成為近代科學研究的熱點[10-11]?？寡趸钚允呛Ｔ骞烟亲钪匾男再|之一，現(xiàn)代研究表明海藻寡糖可以通過清除自由基保護機體免受氧化損傷，達到預防衰老、癌癥、類風濕性關節(jié)炎等疾病的目的[12-13]。但目前有關壇紫菜寡糖抗氧化活性的研究尚未見報道，人們對于壇紫菜多糖降解后抗氧化活性的變化還不清楚。王長云等[14]指出多糖的抗病毒活性與其分子質量有關，Sun Liqin等[15]研究了紫球藻多糖的分子質量與免疫調節(jié)和抗腫瘤活性的關系，證實了多糖活性和聚合度存在關聯(lián)。而目前壇紫菜多糖降解物的活性及其與聚合度的關系尚不明確。因此，對壇紫菜多糖降解物結構和活性的研究具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本實驗采用酶解法對壇紫菜多糖進行降解，以還原糖濃度的高低作為指標，探究紫菜多糖的最佳酶解工藝，然后利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，hPLC）和電噴霧電離質譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）技術對降解物的結構和聚合度進行研究，并且對不同聚合度的降解物進行抗氧化活性的考察，以期為壇紫菜的開發(fā)利用提供技術支持，為新型化妝品、海洋天然藥物及功能性食品的開發(fā)提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜購于福建泉州，于50 ℃烘干至質量恒定，高速粉碎機粉碎，過80 目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

瓊膠酶，分子質量約35 kD，由本實驗室保存的高產瓊膠酶菌株Pseudoalteromonas sp.QJ97發(fā)酵并經(jīng)分離純化制得。

苯酚（分析純） 天津廣成試劑公司；無水乙醇（分析純） 上海埃彼公司；丙酮（分析純） 廣州才允多化工公司；DNS試劑[16]。

1.2 儀器與設備

hhS21-4電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠；ShB-Ⅲ循環(huán)水式多用途真空泵 鄭州長城儀器廠；FD-1A-50真空冷凍干燥機 西安太康生物科技有限公司；布魯克amaZon SL離子阱電噴霧質譜 德國布魯克道爾頓公司；UV751GD紫外-可見光分光光度計 上海分析儀器總廠。

1.3 方法

1.3.1 瓊膠酶溶液的制備

稱取適量凍干的瓊膠酶，溶解于20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，即為瓊膠酶溶液（酶活力為620 U/mL），保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 壇紫菜多糖的提取

取烘干后的壇紫菜干粉，按照1∶40（m/V）加入蒸餾水，混勻，100 ℃加熱4 h，4 800 r/min離心10 min，加3 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置，4 800 r/min離心10 min，去上清，將沉淀溶于適量蒸餾水中，加入一定量體積分數(shù)70%三氯乙酸溶液（至體積分數(shù)達到4%）沉淀蛋白質，4 ℃放置過夜，離心濃縮得壇紫菜多糖溶液。此時，多糖溶液的質量濃度為5.56 mg/mL。

1.3.3 還原糖質量濃度的計算

采用DNS比色法[17]。

1.3.4 壇紫菜多糖得率的計算

總糖質量濃度的測定：采用苯酚-硫酸比色法[18]。

式中：ρ1為樣品糖溶液的總糖質量濃度/（mg/mL）；ρ2為樣品糖溶液的還原糖質量濃度/（mg/mL）；V為樣品糖溶液的體積/mL；m為壇紫菜干質量/mg。

1.3.5 酶解工藝優(yōu)化

1.3.5.1 酶添加量對壇紫菜多糖降解效率的影響

取等量的壇紫菜多糖溶液，分別加入體積分數(shù)為0、2%、4%、6%、8%、10%的瓊膠酶溶液，充分攪拌后于35 ℃反應1 h，立即滅活瓊膠酶，測定還原糖的質量濃度。

1.3.5.2 酶解溫度對壇紫菜多糖降解效率的影響

取等量的壇紫菜多糖溶液，分別置于30、35、40、45、50 ℃預熱10 min，按照最佳添加量加入瓊膠酶，反應1 h，立即滅活瓊膠酶，測定還原糖的質量濃度。

1.3.5.3 pH值對壇紫菜多糖降解效率的影響

改變壇紫菜多糖溶液的pH值，按照最佳添加量加入瓊膠酶，置于最佳酶解溫度，反應1 h，立即滅活瓊膠酶，測定還原糖的質量濃度。

1.3.5.4 酶解時間對壇紫菜多糖降解效率的影響

取等量的壇紫菜多糖溶液，按照最佳條件處理，分別酶解0、0.5、1、2、3、4 h，立即滅活瓊膠酶，測定還原糖的質量濃度。

1.3.5.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，確定影響酶解液還原糖質量濃度的關鍵因素，選擇較優(yōu)的水平進行正交試驗，以期確定最佳的水平。

1.3.6 壇紫菜多糖酶解產物的制備

取適量壇紫菜多糖，加入體積分數(shù)為4%的瓊膠酶溶液，40 ℃酶解6 h后，煮沸5 min，冷卻，加入1.5 倍無水乙醇，4 ℃靜置2 h，4 800 r/min離心10 min，棄去大分子多糖和酶蛋白，上清濃縮再加入3 倍乙醇，靜置沉淀離心，上清液濃縮后加4 倍乙醇，離心得沉淀S1，上清濃縮后加入10 倍乙醇，靜置，4 800 r/min離心10 min，得沉淀S2，樣品透析除鹽，凍干備用。

1.3.7 酶解產物的hPLC分析

將壇紫菜多糖的酶解產物S1進行柱前衍生（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP），然后進行色譜分析。色譜條件：色譜儀：Agilent 1200 Series 高效液相色譜儀；色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18（15 cm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；檢測器為紫外檢測器（VwD），波長254 nm，柱溫及檢測器溫度設定為25 ℃。

1.3.8 酶解產物的ESI-MS分析

分別取少量S1和S2，加乙腈溶解后，取2 μL樣品進行高分辨率負離子模式質譜分析。毛細管電壓：－140 V；質量掃描范圍：m/z 100～2 000。

1.3.9 抗氧化活性的測定

·Oh清除能力采用Smirnoff等[19]的方法測定，略有改進。

式中：A0為蒸餾水代替多糖溶液的空白對照的吸光度；Ai為樣品吸光度；Ai0為多糖本底吸光度。

式中：A0為蒸餾水代替多糖溶液的空白對照的吸光度；Ai為樣品吸光度；Ai0為多糖本底吸光度。

2 結果與分析

2.1 酶解工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗

圖1 酶解條件對壇紫菜多糖降解效率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on the degradation efficiency of Porpyra haitanensis polysaccharide

由圖1a可知，隨著瓊膠酶添加量的增加（0～4%），壇紫菜多糖降解液中還原糖質量濃度逐漸增加。添加量高于4%時，還原糖質量濃度變化不大。瓊膠酶價格昂貴，添加量過大會增加生產的成本，因此選擇4%為最適的酶添加量。酶有特定的反應溫度，溫度過高或過低，酶活力都會有不同程度的損失。由圖1b可知，35～45 ℃，還原糖產量較高，酶活性較好，40 ℃時還原糖質量濃度最高。因此，瓊膠酶適宜的酶解溫度為40 ℃，這與大多數(shù)有關瓊膠酶的報道一致[21]。圖1c顯示，ph值低于或高于6.0，還原糖質量濃度都有不同程度的降低。酶解反應適宜的ph值為6.0，并且瓊膠酶在中性或堿性環(huán)境下酶活損失較大，壇紫菜多糖應調至微酸性。由圖1d可知，0～3 h，還原糖質量濃度增長迅速，3 h后幾乎不再增加。對于工業(yè)生產來說，時間越長，成本越高。因此，酶解壇紫菜多糖的適宜時間為3 h。在最佳工藝條件下酶解壇紫菜多糖所得的酶解液中還原糖的質量濃度達到（1.13±0.18）mg/mL。

2.1.2 正交試驗

選擇酶解溫度、ph值和酶解時間三因素進行L9（34）正交試驗設計，試驗設計及結果見表1。三因素對還原糖質量濃度的影響大小為ph值＞酶解溫度＞酶解時間，其中，ph值影響較顯著。最佳的酶解工藝條件為A2B2C2，即酶解溫度40 ℃、ph 6、酶解時間3 h。在該條件下進行酶解反應得到的壇紫菜多糖降解液中還原糖質量濃度為（1.42±0.12） mg/mL。

表1 壇紫菜多糖酶解條件的正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

2.2 HPLC分析

的HPLC圖Fig.2 High performance liquid chromatograms of S1and S2圖2組分S1和S2

由圖2可知，S1中單糖組分甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖物質的量比為0.4∶0.9∶1.7∶1.4∶92.7∶2.9，各組分含量分別為：半乳糖93.0%、巖藻糖2.6%、葡萄糖醛酸1.8%、葡萄糖1.4%、鼠李糖0.8%、甘露糖0.4%。S2中單糖組分葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖物質的量比為4.7∶2.9∶0.9∶1.5，各組分含量分別為：半乳糖90.5%、葡萄糖醛酸5.0%、葡萄糖3.1%、巖藻糖1.4%。由此可知，壇紫菜酶解產物S1和S2主要以半乳糖作為糖結構單元通過糖苷鍵連接而成，且單糖組成相差不大。

2.3 質譜解析

圖3 組分S（b）的ESI-MS圖Fig.3 ESI-MS spectra of S11（a）和S2(b)(a) and S2

結合高效液相色譜結果以及紫菜多糖的結構[22]，解析ESI-MS圖譜（圖3a）得知，主要的三電荷峰m/z 511.08、613.11、715.14和817.17分別是十糖、十二糖、十四糖和十六糖的離子峰，主要的雙電荷峰m/z 871.19和1 024.23分別是十糖和十二糖的離子峰。綜上，S1由十糖、十二糖、十四糖、十六糖組成，瓊膠酶以二糖作為酶切單元。由圖3b中主峰的荷質比m/z可推知，單電荷峰m/z 727.15和1 033.24分別為帶硫酸基的四糖和六糖，雙電荷峰有m/z 416.57、427.59和569.62，分別為乙?；奈逄?，硫酸化的五糖和乙酰化的七糖。經(jīng)ESI-MS分析S2主要是聚合度為4～6的寡糖的離子峰。說明樣品S2中主要有四糖、五糖、六糖，另有少量二糖、七糖。

2.4 酶解產物的抗氧化能力

·的清除作用Fig.4 Scavenging effects of S1and S2on hydroxyl and superoxide anion radicals圖4S1和S2對·OH和O2

由圖4a可知，樣品質量濃度低于1 mg/mL，S1和S2對·Oh幾乎沒有清除作用，質量濃度1～4 mg/mL，兩樣品對·Oh的清除能力隨樣品質量濃度的增大顯著提高，與S2相比，S1增幅較大。質量濃度達到4 mg/mL，S1的清除率達到65.35%，S2的清除率為34.62%。S1清除·Oh的IC50為2.86 mg/mL。由圖4b可知，兩樣品對O2－·都存在一定的清除作用，質量濃度在0～5 μg/mL時，S1和S2對O2－·的清除能力隨樣品質量濃度的增加而增加，質量濃度高于5 μg/mL時，兩樣品對O2－·的清除能力變化不大。S1對O2－·的清除能力比S2更明顯。

3 結 論

本研究通過單因素和正交試驗確定了紫菜多糖酶解的最佳工藝條件：酶解溫度40 ℃、ph 6.0、酶解時間3 h。優(yōu)化后還原糖產量明顯增加，瓊膠酶的用量大大降低，并且降低生產成本的同時縮短了生產周期。本研究為壇紫菜深加工提供了一種新的方法，為壇紫菜寡糖的規(guī)?；a提供了理論依據(jù)。

通過hPLC對S1和S2進行了單糖組成分析，主要成分都為半乳糖，含量分別為93.0%、90.5%。巖藻糖、葡萄糖、鼠李糖等成分含量很低。該結果與穆凱峰[7]和趙婷婷[23]等對壇紫菜多糖結構的研究結果基本一致。Zhang Zhongshan等[24]測得的壇紫菜多糖的清除·Oh的IC50為2.10 mg/mL，清除O2－·的IC50為18 μg/mL，姚興存等[25]提取的條斑紫菜蛋白清除·Oh的IC50為1.481 mg/mL。本實驗結果表明，酶解產物S1和S2對·Oh和O2－·存在清除作用，尤其對自由基中表現(xiàn)最活躍的·Oh效果明顯。結合S1和S2的組分分析，聚合度在10～16范圍內的偶數(shù)糖比聚合度4～6的壇紫菜寡糖抗氧化能力強，說明壇紫菜多糖經(jīng)酶解后，只有特定聚合度范圍內的壇紫菜降解物才具有明顯的自由基清除作用，目前對這一現(xiàn)象的原因還不清楚，尚需進一步探究。對比壇紫菜多糖降解前后的溶解度變化可知，壇紫菜多糖在室溫下幾乎不溶，S1的溶解度約為10 g/100 g，S2的溶解度遠高于10 g/100 g，瓊膠酶處理后的壇紫菜多糖溶解性會大幅提高，該特性表明壇紫菜多糖降解物在藥品、保健品及化妝品等領域具有的廣闊的應用前景。與機體外實驗相比，寡糖在生物體內代謝較為復雜，其在生物體內的功效仍需進一步研究。

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Enzymatic Degradation of Polysaccharide from Porphyra haitanensis and Analysis of Its Products

HAN Shasha1, HUANG Zhenying1, SHEN Zhaopeng2, CHENG Xiao1, WANG Peng1, JIANG Xiaolu1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The optimal enzymatic hydrolysis conditions for Porphyra haitanensis polysaccharide were determined as 40 ℃, 6.0 and 3 h for hydrolysis temperature, pH and hydrolysis time, respectively, by single factor and orthogonal array design. The yield of reducing sugar was (1.42 ± 0.12) mg/mL under these optimized conditions. The saccharide composition of the two hydrolysate fractions S1and S2was analyzed by liquid chromatography and electrospray ionization mass spectrometry and their antioxidant activity was evaluated. The results revealed that S1and S2had similar composition with galactose as the major component (accounting for 93.0% and 90.5%, respectively), and that both of them had good antioxidant activity, especially for hydroxyl radical scavenging activity. In addition, the degradation products with even degree of polymerization (DP) of 10–16 was more effective in scavenging superoxide anion and hydroxyl radicals than the oligosaccharides with a DP of 4–6 suggesting the relevance of their antioxidant activity to DP, and considerable antioxidant activity existed only in a specific range of DP.

polysaccharide from Porphyra haitanensis; orthogonal array design; composition analysis; degree of polymerization; antioxidant activity

TS254.1

A

1002-6630（2015）21-0145-05

10.7506/spkx1002-6630-201521028

2015-01-10

國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項（201105028-4）

韓莎莎（1989—），女，碩士研究生，研究方向為海洋資源微生物及生物工程。E-mail：hanshahanbing@163.com

*通信作者：江曉路（1959—），女，教授，本科，研究方向為應用微生物。E-mail：jiangxl@ouc.edu.cn