• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬心肌高鐵肌紅蛋白分子結構解析

    2015-12-26 09:43:35李亞東吳名草金邦荃
    食品科學 2015年21期
    關鍵詞:肽鏈肌紅蛋白質譜

    李亞東,吳名草,金邦荃

    (南京師范大學金陵女子學院,江蘇 南京 210097)

    豬心肌高鐵肌紅蛋白分子結構解析

    李亞東,吳名草,金邦荃*

    (南京師范大學金陵女子學院,江蘇 南京 210097)

    本研究分別運用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)、紫外光譜、氨基酸分析、質譜和分子信息技術,比較中國山豬心肌高鐵肌紅蛋白(pig metmyoglobin,pMetMb)分子信息和三維結構。結果表明:pMetMb肽鏈至少含有133 種氨基酸組分,但較hMb缺少脯氨酸(Pro)和精氨酸(Arg);與美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫豬野生型gi|494385比對,其匹配度79.7%(置信度100%),故推測肽鏈長度在133~153之間。pMetMb含有7 個α螺旋和2 個310螺旋,由于310螺旋存在(馬Mb沒有),使肽鏈中疏水基團作用加強,形成更加緊密盤疊的球狀亞基;第6和7螺旋的His64和His93的咪唑基團N(Im N—)與Fe2+/Fe3+鍵合,構成核心heme-Fe功能域;它鑲嵌于蛋白質內部疏水結構內,更便于電子傳遞和Fe2+/Fe3+氧化還原反應,維系肉色。

    高鐵肌紅蛋白;氨基酸種類;α螺旋;分子結構信息;豬心肌

    肉色作為肉品品質的重要質量和經(jīng)濟指標之一,也是消費者購買肉及肉制品的首要參考因素[1-4]。宰后生鮮肉的色澤主要由肌細胞內肌紅蛋白(myoglobin,Mb)的含量及其氧化還原狀態(tài)決定[2-3]。Mb廣泛存在于脊柱動物的心肌和骨骼肌細胞,有3 種存在形式,即Mb、氧合肌紅蛋白(myoglobin-O2,MbO2)和高鐵肌紅蛋白(metmyoglobin,MetMb)[4]。三者不斷進行氧化還原反應,相互轉化,從而維系畜肉理想的鮮紅色[2-3,5-12]。

    隨著對肉色研究的深入,大部分研究者并未對影響肉色的Mb的分子信息和結構特征做出較好的闡釋[2-3,5-7]。為此經(jīng)過10余年的科研工作,本課題組從中國山豬心肌中成功分離純化出了高鐵肌紅蛋白(pMetMb)[13-14],希望通過對其分子信息和化學結構的深入研究,探究其影響豬肉色穩(wěn)定性的分子生物學機理,為進一步的肉色及護色等相關研究提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    馬心肌肌紅蛋白(horse myoglobin,hMb):棕紅色粉末,純度為90.0%,購于美國Sigma公司,為參照。豬心肌高鐵肌紅蛋白(pig metmyoglobin,pMetMb):棕紅色粉末,純度≥93.0%,南京師范大學金陵女子學院功能性食品實驗室制備[13-14]。

    α-腈基-4-羥基苯丙烯酸(純度≥95.0%) 美國Sigma公司;乙腈、三氟乙酸、碘乙酰胺(均為色譜純)德國Merck公司;胰蛋白酶(Trypsin)(質譜純) 美國Promega公司;考馬斯亮藍R-250 美國Amresco公司;蛋白質Marker、丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺(29∶1,m/m,分析純) 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設備

    4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer質譜儀美國ABI公司;GelDoc 2000成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;L-8900全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;UV-6100A紫外分光光度計 上海安銳自動化儀表有限公司;DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 2 種Mb紫外和電泳定性

    0.2 mol/L pMetMb和hMb水溶液置于紫外-可見分光光度計下190~900 nm波長范圍內掃描,檢測其特征峰波長[15];以14.4、20.0、31.0、45.0、66.2、98.0 kD蛋白質標準品為基準,將純化后pMetMb于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)100 V、2~3 h條件下電泳(5%濃縮膠、12%分離膠、考馬斯亮藍R-250染色后脫色)并成像,得到其表觀分子質量[13-14];重復6 次。

    1.3.2 2 種Mb氨基酸組分及比對

    參照GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測定》,分別將2 種Mb按1∶1(m/V)溶于6 mol/L HCl,110 ℃條件下至完全消化,用全自動氨基酸分析儀檢測2 種Mb酸解氨基酸組分(amino acids,AAs),計算AAs種類、數(shù)量和百分比并進行2 種Mb間的比對[16]。

    1.3.3 pMetMb分子結構信息解析

    pMetMb裂解:將pMetMb按1∶5(m/V)溶于10 mg/mL胰蛋白酶液中,于37 ℃水浴20 h,之后加入100 μL 60%乙腈-0.1%三氟乙酸15 min超聲并于-83 ℃凍干后備用。

    pMetMb一級結構質譜解析:質譜儀工作條件:200 Hz/355 nm Nd-YAG激光器、2 kV加速電壓及碰撞能量、800~4 000 D肽指紋圖譜(peptide mass fingerprinting,PMF)質量掃描區(qū)域、信噪比大于50母離子、2 500 次激發(fā)二級質譜(mass spectrometry/mass spectrometry,MS/MS)、正離子模式自動采集數(shù)據(jù);NCBI-SUS scrofa數(shù)據(jù)庫、MS+MS/MS的Masot軟件聯(lián)合檢索。

    pMetMb裂解液凍干粉復溶于2 μL體積分數(shù)20%乙腈,取1 μL復溶液點于不銹鋼靶板(384 孔)并自然干燥,再滴加0.5 μL過飽和α-腈基-4-羥基苯丙烯酸基質溶液(50%乙腈-0.1%三氟乙酸)并自然干燥,之后置于4800基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間二級質譜(matrixassisted laser desorption ionization time of flight/ionization time of flight-MS,MALDI TOF/TOF-MS),進行小片段肽鏈的氨基酸序列解析[17]。

    1.3.4 2 種Mb分子結構信息比對

    2 種Mb氨基酸序列同源性和差異性,采用美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫及其中NCBI-BLASTp計算軟件進行計算[18];且在PDB數(shù)據(jù)庫中,運用pyMOL軟件推演并顯示pMetMb二級結構和三級結構。

    2 結果與分析

    2.1 pMetMb和hMb的化學態(tài)分析

    經(jīng)紫外全程掃描,pMetMb和hMb均在409 nm波長處的Mb特征區(qū)域呈現(xiàn)蛋白質特征峰,故同屬哺乳類Mb(圖1);不論是否采用K3Fe(CN)6氧化hMb,hMb、hMb+K3Fe(CN)6和pMetMb的特征峰高度重合,其中hMb和hMb+K3Fe(CN)6峰高和出峰時間高度一致,說明hMb實質為馬心肌高鐵肌紅蛋白(horse metmyoglobin,hMetMb),可與pMetMb進行同類化合物分子信息和結構的比較[19]。在前人研究的基礎上可知[20-21],409 nm是MetMb紫外特征吸收波長,而MbO2的紫外特征吸收波長則在420、540、580 nm左右處,Mb在430、560 nm左右處。由此可鑒定所獲得蛋白質的MetMb化學態(tài)歸屬,因此本實驗制備的豬心肌pMetMb確實歸屬于氧化態(tài)的MetMb。

    SDS-PAGE法測得pMetMb表觀分子質量為17 kD,而hMb分子質量為16.9 kD[22-23](圖2)。眾所周知,Mb在長期進化中具有高度穩(wěn)定性和傳承性,尤其在高等哺乳類動物中,心肌源的Mb在分子質量上高度接近,差異不足4%[18,23-24]。

    從hMb和pMetMb水溶液電泳和紫外掃描結果判斷:二者均為單條帶的單一肽鏈蛋白質,409 nm波長處呈現(xiàn)紫外特征光譜,均屬于氧化態(tài)Mb,即MetMb,故hMb可作為本研究參照物。

    圖1 pMetMb和hMb紫外光譜Fig.1 UV spectra of pMetMb and hMb

    圖2 pMetMb的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of pMetMb

    2.2 2 種MetMb氨基酸組分

    2.2.1 氨基酸種類的比較

    表1 2種MetMb氨基酸組成Table 1 Amino acid comparison of two MetMbs

    由表1、圖3可知,2 種MetMb鹽酸水解后,揭示出pMetMb和hMetMb分別由15、17 種AAs組成;其中pMetMb AAs與hMetMb相比缺失脯氨酸(Pro)和精氨酸(Arg);經(jīng)比對,2 種蛋白質AAs種類同源性高達88.2%,差異僅為11.8%,符合同源蛋白質基本規(guī)律;因物種進化,馬屬于哺乳類動物中的草食動物,而豬屬于雜食動物,在早期物種分化上早已分支,它們心肌Mb/MetMb的AAs種類從而發(fā)生了微小改變,并具備了各自物種的特征[23-24]。

    圖3 hMetMb(a)和pMetMb(b)的氨基酸組分Fig.3 Amino acid composition of hMetMb (a) and pMetMb (b)

    2.2.2 氨基酸比例的比較

    根據(jù)組分中每一氨基酸的峰高和半峰寬計算其所占總數(shù)比例,結果發(fā)現(xiàn)2 種MetMb中17 種AAs比例不盡相同,其中pMetMb AAs組分缺少Pro和Arg,其比例分別記為0%,因此pMetMb和hMetMb中這兩種氨基酸比例差異達100%;比較其他15 種AAs,對應的比例均不相同,存在不同程度的差異(表1,圖3)。

    經(jīng)分析,二者均有8 種AAs比例超過5%。pMetMb組分中His比例最高,達到18.99%;hMetMb中Lys最高,達到14.95%,其次是12.73% Glu和12.44% Leu。比較后注意到,hMetMb中Lys比例幾乎是pMetMb的2 倍,而Cys+ Met比例則明顯低于pMetMb(表1,圖3)。

    對2 種MetMb中17 種AAs所占比例進一步分析,僅Pro、Arg、Phe、Met、Cys、Gly和Ile 7 種AAs的比例差異較大,平均73.73%;Tyr無差異;其他AAs比例差異都在50%以下,其中僅Ser和Ala差異在20%以下,分別為10.92%和6.75%。經(jīng)加權分析(AAs種類差異性/%= {[(1.74+6.05)×55.33+(2.12+2.64)×10.92+(6.15+7.04)×6.75+(1.82+4.32)×40.72+(7.90+ 3.50)×38.60+(1.42+4.78)×54.19+(6.26+12.44)× 33.05+(2.27+2.27)×0+(0+4.12)×100+(5.45+1.19)×64.16+(0+1.61)×100+(0.19+ 1.09)×70.31+(7.12+12.73)×28.26+(3.61+7.21)× 33.27+(7.43+14.95)×33.60+(7.43+6.43)×72.15+(18.99+10.54)×28.61+(2.97+1.71)×26.92] /(2×17×104)}×100),2 種MetMb AAs比例的同源性為98.1%,差異性僅為1.9%,屬于高度同源的蛋白質。

    2.3 2 種MetMbs肽鏈氨基酸序列解析與比較

    2.3.1 pMetMb氨基酸序列解析

    酶解pMetMb經(jīng)MALDI TOF質譜累積掃描25 次,得到一級質譜的肽指紋圖譜。由圖4可知,800~4 000 D范圍內共有137 個肽片段;進一步縮小分子質量范圍,800~2 000 D含有104 個肽片段,2 000~3 000 D中有21 個肽片段,而3 000~4 000 D中僅含12 個肽片段,該蛋白質酶解后肽鏈AAs片段主要集中在800~2 000 D,占總數(shù)的76%。

    圖4 MALDI-TOF質譜pMetMb離子峰Fig.4 Peptide ions of pMetMb in MALDI TOF mass spectrum

    選取一級質譜中峰型好、強度高的離子峰片段,高能量(2 kV)碰撞誘導肽片段進一步裂解(collisioninduced dissociation,CID),并用MALDI TOF/TOF二級質譜累積掃描2 500 次,從而獲得8 個二級質譜的肽碎片指紋圖譜(peptide fragment fingerprinting,PFF),即8 個氨基酸序列小片段。根據(jù)pMetMb的PMF結合其8 個PFF,在NCBI數(shù)據(jù)庫蛋白質豬源子庫(gi)進行搜索和比對,僅得到PMF中m/z 1 955.268 6及8 個PFF中m/z 1 393.990 6、1 488.850 5、1 593.070 1和1 827.156 6這5 片段精確氨基酸排序,一級結構與gi|494385匹配最近,725 分Mascot,置信度100%,匹配度79.7%(圖5,表2)。

    圖5 MALDI TOF/TOF質譜pMetMb離子峰Fig.5 Peptide ions of pMetMb by MALDI TOF/TOF mass spectrometry

    表2 pMetMb肽鏈AAs序列NCBI數(shù)據(jù)庫檢索Table 2 Peptide sequence alignment of pMetMb in NCBI

    pMetMb 5 片段氨基酸序列依次命名為A、B、C1、C2和D片段(圖6),分別起始于17~31位(15 AAs)、64~77 位(14 AAs)、80~96 位(17 AAs)、79~96 位(18 AAs)和119~133 位(15 AAs)。

    研究發(fā)現(xiàn),其中C2片段在N端比C1片段多一位Lys;同時在m/z 2 083.396 2 處的一級質譜解讀到另一離子峰,與數(shù)據(jù)庫gi|494385比對,該片段可能是19 AAs多肽,且在N端再增加一位K,因此其肽鏈AAs序列推測為KKGHHEAELTPLAQSHATK,且指認為C3片段。pMetMb肽鏈可任意在第80位、第79位或第78位Lys處被Trypsin水解或剪切,形成C1、C2和C3片段,只是分子質量或AAs序列略有不同(圖4,圖6),符合前人推理[25]。由此表明,本實驗室制備的pMetMb肽鏈AAs序列至少含有133 AAs,與蛋白質數(shù)據(jù)庫豬子庫中gi|494385豬野生型Mb/MetMb分子信息高度同源,故pMetMb肽鏈AAs的一級結構歸屬于豬種MetMb。

    研究進一步分析了B和C片段AAs序列(圖6),發(fā)現(xiàn)第64位(B片段)和93位(C片段)的His在蛋白質α螺旋過程中,2 His所在咪唑基團(Imidazole,Im)高度接近,可能是構成heme的基礎。其中N—可與Fe2+/Fe3+形成配位,不斷由6配位低自旋(heme-Fe3+)轉化為5配位高自旋(heme-Fe2+),通過電子傳遞攜帶O2,營養(yǎng)肌肉組織,以維系肉色穩(wěn)定[2-3]。經(jīng)紫外光譜證實:在409 nm波長處存在heme-Fe3+結構特征峰(圖1),佐證了在B和C片段處形成heme環(huán)狀結構的可能性。

    圖6 MetMb肽鏈氨基酸序列Fig.6 Amino acid sequences in 2 MetMb

    2.3.2 2 種MetMbs氨基酸同位置換及差異

    根據(jù)蛋白質NCBI數(shù)據(jù)庫檢索,得到一高度同源的豬野生型Mb/MetMb(gi|494385)和馬心肌Mb/MetMb(gi|157834316)分子信息,它們肽鏈均為153 AAs。由本實驗室制備的pMetMb其MALDI TOF/TOF質譜得到的結果,它的分子信息與豬野生型gi|494385高度匹配,因此本實驗以豬gi|494385和馬gi|157834316進行物種間AAs序列比對。

    2 種MetMbs比對(BLASTp)后發(fā)現(xiàn),AAs序列中有14 位點同位置換,分別在第9位(Leu/Gln)、第21位(Val/Ile)、第34位(Lys/Thr)、第51位(Ser/Thr)、第53位(Asp/ Ala)、第66位(Asn/Thr)、第67位(Thr/Val)、第87位(Thr/Lys)、第101位(Val/Ile)、第109位(Glu/Asp)、第113位(Gln/His)、第116位(Gln/His)、第132位(Ser/Thr)和第142位(Met/Ile),其物種間差異僅為9.2%(圖6)。

    進一步統(tǒng)計2 種MetMbs肽鏈中相同AAs個數(shù),其中7 種AAs(Gly、Tyr、Pro、Cys、Arg、Asp和Phe)個數(shù)完全一致,另5 種AAs(Ala、Val、Leu、Glu和Lys)個數(shù)達到98.8%,僅Ser、Thr、His、Ile和Met 5 種AAs個數(shù)差異較大(表3)。

    表3 2種MetMb肽鏈的氨基酸個數(shù)Table 3 Number comparison of amino acids between two MetMb

    本研究分析表明,Mb/MetMb是高度進化的蛋白質,尤其在高等哺乳類動物間,豬和馬的同源性可高達90.8%。

    2.4 pMetMb高級結構解析

    2.4.1 二級結構解析

    NCBI數(shù)據(jù)庫中pMetMb與豬野生型Mb/MetMb(gi|494385)的AAs序列比對,二者匹配度79.7%,為高度同源蛋白質。

    MALDI TOF/TOF得到的pMetMb 4/5典型小肽片段,經(jīng)PDB二級結構解析,解讀出pMetMb具有7 個α螺旋和2 個310螺旋共9 個螺旋結構。A、B、C1/C2和D小肽片段分別構成第2螺旋、第6螺旋、第7螺旋和第9螺旋N端部分區(qū)域,還包括第6、7螺旋和第8、9螺旋間的無規(guī)卷曲。

    文獻指出,其他大多數(shù)哺乳類動物,如抹香鯨或馬,肌紅蛋白二級結構僅有8 個α螺旋[4,26];但豬的第3螺旋結構被分裂成2 個310螺旋,即形成第3和第4螺旋[27]。由于310螺旋更緊密,片段更短,更有利于肽鏈三級結構的形成。本實驗前期采用光譜學手段,指認pMetMb二級結構,其α螺旋結構可高達50%,屬于高度螺旋的球狀蛋白質[28-29]。

    由于第6和7螺旋在空間結構上相互靠近,二螺旋間的無規(guī)卷曲形成疏水間隙,heme-Fe鑲嵌其中,heme-Fe兩側的His64和His93通過咪唑環(huán)N—與Fe2+/Fe3+形成配位結構,其作用力使二螺旋間的無序卷曲發(fā)生彎曲,從而導致第6和第7螺旋空間結構進一步相向接近,更有利于Fe2+和Fe3+電子傳遞,從而構成Mb/MetMb核心結構功能域[4,27,30]。

    2.4.2 三級空間結構推演

    圖7 pMetMb空間結構Fig.7 Spatial structure of pMetMb

    采用pyMOL軟件,推演pMetMb三級空間結構。由于該蛋白質肽鏈結構可形成7 個α螺旋和2 個310螺旋,螺旋與螺旋間在側鏈基團(H—H,S—S等)的非極性鍵作用下,緊密盤曲折疊,形成球狀結構(圖7A);在第6和7螺旋間形成內部狹窄的疏水間隙,即在球蛋白質分子表面出現(xiàn)凹陷區(qū)域,官能團heme-Fe鑲嵌于此(圖7B)。

    3 結 論

    通過對pMetMb較hMetMb中AAs組分的解析、計算和比對,pMetMb較hMetMb缺失Pro和Arg,且AAs比例和個數(shù)不盡相同。但它們種類同源性達88.2%,比例和個數(shù)分別為98.1%和90.8%,證明二者AAs組分高度同源。

    一級結構測序說明pMetMb肽鏈至少含有133 種AAs;經(jīng)將5 個重點小肽片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中豬野生型gi|494385精確比對,其79.7%匹配度(置信度100%)證明研究獲得的pMetMb屬于豬源MetMb,而推測出pMetMb肽鏈中AAs序列長度在133~153之間。

    pMetMb的二、三級結構含有7 個α螺旋和2個310螺旋,且螺旋間存在部分無規(guī)卷曲;由于310螺旋存在,二級結構中疏水基團更易相互作用,形成緊密折疊的球狀亞基。

    pMetMb肽鏈His64和His93分別位于第6和第7螺旋,2 His Im N-形成內部疏水結構,與Fe2+/Fe3+鍵合后構成核心功能域,導致heme-Fe2+/Fe3+官能團鑲嵌于此,更便于電子傳遞和Fe2+/Fe3+氧化還原反應,以維系理想肉色。

    [1] QUEVEDO R, VALENCIA E, CUEVAS G, et al. Color changes in the surface of fresh cut meat: a fractal kinetic application[J]. Food Research International, 2013, 54(2): 1430-1436.

    [2] MANCINI R A, HUNT M C. Current research in meat color[J]. Meat Science, 2005, 71(1): 100-121.

    [3] BEKHIT A E D, FAUSTMAN C. Metmyoglobin reducing activity[J]. Meat Science, 2005, 71(3): 407-439.

    [4] HENGGEN-COTTA U B, KELM M, RASSAF T. Myoglobin functions in the heart[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2014, 73: 252-259.

    [5] 王瑋, 湯祥明, 金邦荃. 高鐵肌紅蛋白含量和高鐵肌紅蛋白還原酶活性與冷鮮肉肉色穩(wěn)定性關系的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(7): 94-97.

    [6] MIKKELSEN A, JUNCHER D, SKIBSTED L H. Metmyoglobin reductase activity in porcine m. longissimus dorsi muscle[J]. Meat Science, 1999, 51(2): 155-161.

    [7] JACOB R H, D’ANTUONO M F, GILMOUR A R, et al. Phenotypic characterisation of colour stability of lamb meat[J]. Meat Science, 2014, 96(2): 1040-1048.

    [8] BEKHIT A E D, GEESINK G H, ILIAN M A, et al. The effects of natural antioxidants on oxidative processes and metmyoglobin reducing activity in beef patties[J]. Food Chemistry, 2003, 81(2): 175-187.

    [9] BEKHIT A E D, GEESINK G H, ILIAN M A, et al. Particulate metmyoglobin reducing activity and its relationship with meat color[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(20): 6026-6035.

    [10] SAMMEL L M, HUNT M C, KROPF D H, et al. Comparison of assays for metmyoglobin reducing ability in beef inside and outside semimembranosus muscle[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(3): 978-984.

    [11] 白鳳霞, 孔保華, 戴瑞彤. 肉類顏色的影響因素研究[J]. 肉類研究, 2009, 23(4): 15-19.

    [12] BEKHIT A E D, GEESINK G H, MORTON J D, et al. Metmyoglobin reducing activity and colour stability of ovine longissimus muscle[J]. Meat Science, 2001, 57(4): 427-435.

    [13] 湯祥明, 金邦荃, 劉興余. 豬心肌高鐵肌紅蛋白的提取和純化[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2006, 38(7): 34-36.

    [14] 湯祥明, 金邦荃, 劉興余. 從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法:中國, 200610037909.X[P]. 2008-01-25.

    [15] BANERJEE S, CHAKRABORTI A S. Structural alterations of hemoglobin and myoglobin by glyoxal: a comparative study[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 66: 311-318.

    [16] GB/T 18246—2000 飼料中氨基酸的測定[S].

    [17] DOSI R, CARUSONE A, CHAMBERY A, et al. Rapid primary structure determination of myoglobins by a complementary approach based on mass spectrometry and Edman degradation[J]. Food Chemistry, 2012, 133(4): 1646-1652.

    [18] JOSEPH P, SUMAN S P, LI Shuting, et al. Amino acid sequence of myoglobin from white-tailed deer (Odocoileus virginianus)[J]. Meat Science, 2012, 92(2): 160-163.

    [19] SMERDON S J, KRZYWDA S, BRZOZOWSKI A M, et al. Interactions among residues CD3, E7, E10, and E11 in myoglobins: attempts to simulate the ligand-binding properties of Aplysia myoglobin[J]. Biochemistry, 1995, 34(27): 8715-8725.

    [20] KUMAR A, VENKATESU P. A comparative study of myoglobin stability in the presence of Hofmeister anions of ionic liquids and ionic salts[J]. Process Biochemistry, 2014, 49(12): 2158-2169.

    [21] BHATTACHERJEE A, CHAKRABORTI A S. Fructose-induced modifications of myoglobin: change of structure from met (Fe3+) to oxy (Fe2+) form[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 48(1): 202-209.

    [22] di GIUSEPPE A M A, GIARRETTA N, LIPPERT M, et al. An improved UPLC method for the detection of undeclared horse meat addition by using myoglobin as molecular marker[J]. Food Chemistry, 2015, 169(15): 241-245.

    [23] GIARETTA N, di GIUSEPPE A M A, LIPPERT M, et al. Myoglobin as marker in meat adulteration: a UPLC method for determining the presence of pork meat in raw beef burger[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 1814-1820.

    [24] JOSEPH P, SUMAN S P, LI Shuting, et al. Primary structure of turkey myoglobin[J]. Food Chemistry, 2011, 129(1): 175-178.

    [25] 王勇, 李水明, 何曼文. 基質輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時間質譜鑒定鯊魚硒結合蛋白[J]. 質譜學報, 2013, 34(5): 257-262.

    [26] EVANS S V, BRAYER G D. High-resolution study of the threedimensional structure of horse heart metmyoglobin[J]. Journal of Molecular Biology, 1990, 213(4): 885-897.

    [27] OLDFIELD T J, SMERDON S J, DAUTER Z, et al. High-resolution X-ray structures of pig metmyoglobin and two CD3 mutants: Mb (Lys45. fwdarw. Arg) and Mb (Lys45. fwdarw. Ser)[J]. Biochemistry, 1992, 31(37): 8732-8739.

    [28] 吳名草, 金邦荃, 陳許明, 等. 紫外照射下高鐵肌紅蛋白變化的同步熒光光譜指認[J]. 激光與光電子學進展, 2013, 50(5): 197-203.

    [29] 吳名草, 金邦荃, 陳許明, 等. 豬心肌高鐵肌紅蛋白分子動力學結構功能域的熒光光譜指認[C]//全國動物生理生化第十二次學術交流會論文摘要匯編, 2012.

    [30] SHIKAMA K. Nature of the FeO2bonding in myoglobin and hemoglobin: a new molecular paradigm[J]. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 2006, 91(1/2): 83-162.

    Structural Elucidation of Metmyoglobin in Pig Myocardium

    LI Yadong, WU Mingcao, JIN Bangquan*
    (Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

    The structural elucidation of metmyoglobin (Mb) is helpful for understanding the mechanism of meat color. Molecular information and three-dimensional structure of metmyoglobin (pMetMb) in pig myocardium were studied by SDS-PAGE, UV spectroscopy, amino acid analysis, mass spectrometry and bioinformatics. The peptide chain of pMetMb was composed of at least 133 amino acids (AAs). AAs from pMetMb lacked proline (Pro) and arginine (Arg) compared with horse Mb (hMb). pMetMb was matched 79.7% (100% confidence) with gi|494385 in NCBI database, suggesting that the length of pMetMb peptide was in the range of 133-153 AAs including 7 α-helixes and 2 310helixes in its secondary structure. Due to the 310helixes, hydrophobic groups in pMetMb had increased interaction with each other and the peptide chain highly folded as globin subunit, while hMb contained no 310helixes. Both His64 and His93 located at the 6thα-helix and 7thα-helix contained imidazole group with nitrogen (N-) that could bind with Fe2+/Fe3+to form heme-Fe domain which was embed into hydrophobic groups, facilitating electron transfer and oxidation-reduction and consequently for maintaining desirable meat color.

    metmyoglobin (MetMb); amino acids; alpha helix; molecular and structural information; pig myocardium

    TS251

    A

    1002-6630(2015)21-0062-06

    10.7506/spkx1002-6630-201521013

    2015-01-05

    江蘇省自然科學基金項目(BK2009402);江蘇省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目(CX(11)1301)

    李亞東(1989—),男,碩士研究生,研究方向為食品肉品學。E-mail:ns_liyadong@163.com

    *通信作者:金邦荃(1956—),女,教授,博士,研究方向為食品科學。E-mail:jinbangquan@njnu.edu.cn

    猜你喜歡
    肽鏈肌紅蛋白質譜
    氣相色譜質譜聯(lián)用儀在農(nóng)殘檢測中的應用及維護
    缺血修飾白蛋白和肌紅蛋白對急性冠狀動脈綜合征的早期診斷價值
    床旁即時檢測儀用于野外軍訓檢測尿液肌紅蛋白的應用研究
    例談基因表達過程中多種肽鏈的合成
    中學生物學(2019年2期)2019-04-16 00:54:00
    吹掃捕集-氣相色譜質譜聯(lián)用測定水中18種揮發(fā)性有機物
    烷基鏈長及肽鏈電荷分布對脂肽雙親分子自組裝及水凝膠化的影響
    膠原蛋白Ⅳ在腫瘤領域的研究進展
    “蛋白質的分子結構和功能”難點掃描
    考試周刊(2014年46期)2014-08-15 20:58:06
    棗霜化學成分的色譜質譜分析
    Modeled response of talik development under thermokarst lakes to permafrost thickness on the Qinghai-Tibet Plateau
    91国产中文字幕| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 只有这里有精品99| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产日韩欧美亚洲二区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产成人av教育| 丁香六月天网| 午夜激情久久久久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 黄片播放在线免费| 女性生殖器流出的白浆| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 不卡av一区二区三区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 最新在线观看一区二区三区 | 制服人妻中文乱码| 人妻一区二区av| 91精品国产国语对白视频| e午夜精品久久久久久久| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 中国国产av一级| 少妇人妻 视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费在线观看完整版高清| 丝袜在线中文字幕| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产成人精品无人区| 精品人妻在线不人妻| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲国产av新网站| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 我的亚洲天堂| 极品人妻少妇av视频| 伊人亚洲综合成人网| 国产91精品成人一区二区三区 | 久久天堂一区二区三区四区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 色播在线永久视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 色精品久久人妻99蜜桃| 捣出白浆h1v1| 亚洲少妇的诱惑av| 久久久久久久久免费视频了| 人人妻人人澡人人看| 免费观看人在逋| 欧美激情 高清一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 精品少妇内射三级| 亚洲av男天堂| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 中文精品一卡2卡3卡4更新| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 色播在线永久视频| 男女边吃奶边做爰视频| 中文欧美无线码| 久久国产精品大桥未久av| 国产免费又黄又爽又色| 国产精品久久久久久精品古装| 看免费av毛片| 女人精品久久久久毛片| 视频在线观看一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 69精品国产乱码久久久| 香蕉丝袜av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日韩视频在线欧美| 久久久久久人人人人人| 午夜激情av网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 91老司机精品| 多毛熟女@视频| 两人在一起打扑克的视频| 69精品国产乱码久久久| 亚洲av国产av综合av卡| 大话2 男鬼变身卡| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲成人国产一区在线观看 | av福利片在线| 久久久亚洲精品成人影院| 99国产综合亚洲精品| www.999成人在线观看| 久久久欧美国产精品| 男人添女人高潮全过程视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜视频精品福利| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品国产国语对白av| 一级毛片电影观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 成年人黄色毛片网站| 一级片免费观看大全| 免费观看人在逋| 午夜福利在线免费观看网站| 日本黄色日本黄色录像| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久精品国产a三级三级三级| 免费在线观看影片大全网站 | 日韩电影二区| videos熟女内射| 久久久久久人人人人人| 激情视频va一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| av国产精品久久久久影院| 亚洲国产精品一区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 国产97色在线日韩免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品一国产av| 久久九九热精品免费| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 久久精品久久精品一区二区三区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 成人国产av品久久久| 美女福利国产在线| 脱女人内裤的视频| 国产成人av激情在线播放| 欧美久久黑人一区二区| 成人影院久久| 多毛熟女@视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品欧美一区二区三区在线| 狂野欧美激情性xxxx| 免费不卡黄色视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲国产av新网站| 精品国产一区二区久久| 最新的欧美精品一区二区| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 下体分泌物呈黄色| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 免费日韩欧美在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩视频精品一区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一区在线观看完整版| 男人操女人黄网站| 99香蕉大伊视频| 十八禁人妻一区二区| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 手机成人av网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 色综合欧美亚洲国产小说| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产一区亚洲一区在线观看| 少妇的丰满在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| www.熟女人妻精品国产| 男女国产视频网站| 亚洲情色 制服丝袜| 高潮久久久久久久久久久不卡| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产99久久九九免费精品| 在线观看免费高清a一片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美国产精品va在线观看不卡| 下体分泌物呈黄色| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品熟女久久久久浪| 国产激情久久老熟女| 91国产中文字幕| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 美女国产高潮福利片在线看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 午夜福利在线免费观看网站| 日本91视频免费播放| 丝袜脚勾引网站| 夫妻午夜视频| 欧美精品一区二区免费开放| 老汉色av国产亚洲站长工具| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产在视频线精品| 成人三级做爰电影| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久久国产精品麻豆| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日韩人妻精品一区2区三区| 成年美女黄网站色视频大全免费| av网站免费在线观看视频| 1024视频免费在线观看| 香蕉国产在线看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一区二区av电影网| 国产一区二区 视频在线| 亚洲av片天天在线观看| 国产野战对白在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美激情高清一区二区三区| 男的添女的下面高潮视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 麻豆国产av国片精品| 国产成人免费观看mmmm| 最新在线观看一区二区三区 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美精品亚洲一区二区| 国产一级毛片在线| 老熟女久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲情色 制服丝袜| 色播在线永久视频| 下体分泌物呈黄色| 丝袜在线中文字幕| av在线老鸭窝| 另类亚洲欧美激情| 看免费成人av毛片| 性色av乱码一区二区三区2| 又大又爽又粗| 亚洲人成电影免费在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 中国国产av一级| 精品国产国语对白av| 国产精品99久久99久久久不卡| 美女视频免费永久观看网站| 午夜两性在线视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产在线观看jvid| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲成色77777| 麻豆av在线久日| 视频区图区小说| 午夜老司机福利片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品久久久久成人av| 午夜激情av网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 在线观看免费视频网站a站| 久久鲁丝午夜福利片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品成人在线| 亚洲成国产人片在线观看| 人人澡人人妻人| 欧美性长视频在线观看| 蜜桃国产av成人99| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 捣出白浆h1v1| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美成狂野欧美在线观看| 大码成人一级视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 麻豆乱淫一区二区| 丝袜喷水一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲欧美一区二区三区国产| 嫩草影视91久久| 1024香蕉在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 久9热在线精品视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 丝袜脚勾引网站| 亚洲少妇的诱惑av| 99国产精品免费福利视频| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产av新网站| 亚洲国产精品一区三区| 热99国产精品久久久久久7| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品国产av在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 黄色一级大片看看| 日韩一本色道免费dvd| 成人国语在线视频| 精品第一国产精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美+亚洲+日韩+国产| 1024香蕉在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 久久这里只有精品19| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产三级黄色录像| 91国产中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 久久精品久久久久久久性| 免费少妇av软件| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产精品国产三级专区第一集| 国产成人免费观看mmmm| 国产1区2区3区精品| 妹子高潮喷水视频| 精品视频人人做人人爽| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99热国产这里只有精品6| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 男女午夜视频在线观看| 黄色一级大片看看| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产男人的电影天堂91| 久久精品国产综合久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美黄色片欧美黄色片| 男女边摸边吃奶| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲精品国产av成人精品| 国产高清视频在线播放一区 | 国产av一区二区精品久久| 性色av乱码一区二区三区2| 精品国产乱码久久久久久小说| 激情五月婷婷亚洲| 丝袜美足系列| 亚洲精品国产av成人精品| 高清欧美精品videossex| 一本大道久久a久久精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲一区中文字幕在线| 老司机在亚洲福利影院| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 秋霞在线观看毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜视频精品福利| 亚洲伊人色综图| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| av线在线观看网站| 亚洲少妇的诱惑av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 国产在线视频一区二区| 九草在线视频观看| 香蕉丝袜av| 中国美女看黄片| 亚洲欧洲日产国产| 狂野欧美激情性bbbbbb| 考比视频在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产日韩欧美视频二区| 欧美黄色片欧美黄色片| 香蕉国产在线看| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产成人欧美| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久国产亚洲av麻豆专区| 自线自在国产av| 午夜福利在线免费观看网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品人妻1区二区| 国产av精品麻豆| 少妇的丰满在线观看| 久久久久网色| 考比视频在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 丝袜在线中文字幕| 女人久久www免费人成看片| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品国产av成人精品| 国产又爽黄色视频| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲综合色网址| 国产黄色视频一区二区在线观看| kizo精华| 欧美日韩视频精品一区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲 国产 在线| 99国产综合亚洲精品| 777米奇影视久久| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲第一青青草原| 成人黄色视频免费在线看| 男男h啪啪无遮挡| 欧美av亚洲av综合av国产av| 男女下面插进去视频免费观看| 激情五月婷婷亚洲| 欧美日韩黄片免| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 91精品伊人久久大香线蕉| 丝袜喷水一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 91老司机精品| 乱人伦中国视频| 国产有黄有色有爽视频| 高清av免费在线| 青春草亚洲视频在线观看| 无限看片的www在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品高清国产在线一区| 国产日韩欧美视频二区| 无遮挡黄片免费观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 女警被强在线播放| 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久精品国产亚洲av涩爱| 黄频高清免费视频| 观看av在线不卡| 午夜久久久在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品福利观看| 91字幕亚洲| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品免费久久久久久久清纯 | 少妇粗大呻吟视频| 人妻一区二区av| 国产麻豆69| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产又色又爽无遮挡免| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲,一卡二卡三卡| 成年av动漫网址| 男女免费视频国产| 久久影院123| 国产高清视频在线播放一区 | 午夜福利免费观看在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 天堂俺去俺来也www色官网| 女性生殖器流出的白浆| www.精华液| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲国产成人一精品久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 不卡av一区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲国产av新网站| 午夜激情av网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产视频一区二区在线看| 久久精品人人爽人人爽视色| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 老司机靠b影院| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲国产精品一区三区| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 亚洲国产欧美在线一区| 欧美成人午夜精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品 欧美亚洲| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 丁香六月天网| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品久久久精品久久久| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲欧洲国产日韩| 九色亚洲精品在线播放| 看十八女毛片水多多多| 国产男女内射视频| 男人舔女人的私密视频| 老鸭窝网址在线观看| 91精品国产国语对白视频| avwww免费| 精品国产一区二区久久| 少妇 在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 国产视频首页在线观看| 97在线人人人人妻| 一区二区三区精品91| 我要看黄色一级片免费的| 久久精品国产亚洲av涩爱| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 下体分泌物呈黄色| 视频区欧美日本亚洲| 国产视频首页在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 两性夫妻黄色片| 国产片特级美女逼逼视频| 黄色一级大片看看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品人妻1区二区| 亚洲美女黄色视频免费看| 女性被躁到高潮视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 男女国产视频网站| 91成人精品电影| 久9热在线精品视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 夫妻性生交免费视频一级片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日韩电影二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 99国产精品一区二区三区| 黄色一级大片看看| 欧美精品av麻豆av| 在线观看一区二区三区激情| 日本午夜av视频| 亚洲精品第二区| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲人成电影观看| 国产精品熟女久久久久浪| videosex国产| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲图色成人| 日本av免费视频播放| 国产精品99久久99久久久不卡| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一级毛片女人18水好多 | 大码成人一级视频| 嫩草影视91久久| 制服诱惑二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 真人做人爱边吃奶动态| 久久av网站| 欧美另类一区| 美女午夜性视频免费| 一级毛片 在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 最新的欧美精品一区二区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 一级毛片女人18水好多 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产日韩欧美亚洲二区| 女警被强在线播放| 美女视频免费永久观看网站| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久网色| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 丝袜美足系列| 国产在线免费精品| 午夜免费鲁丝| 热99久久久久精品小说推荐| 久久久国产一区二区| 国产成人系列免费观看| 少妇人妻久久综合中文| 99国产精品一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 99久久综合免费| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品少妇久久久久久888优播| 国产伦理片在线播放av一区| 久久久精品94久久精品| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品人妻久久久影院| 国产野战对白在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲欧洲国产日韩| 男人舔女人的私密视频| av福利片在线| 三上悠亚av全集在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久热爱精品视频在线9| 男女下面插进去视频免费观看| 99国产精品一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 在线观看免费视频网站a站| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美日韩一级在线毛片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲综合色网址| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲七黄色美女视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美av亚洲av综合av国产av| 中文欧美无线码| 欧美性长视频在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 蜜桃在线观看..| 国产成人免费观看mmmm| 久久精品久久久久久久性| 国产亚洲精品久久久久5区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美在线黄色| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | bbb黄色大片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 看免费av毛片| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久视频综合| 999久久久国产精品视频| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 两人在一起打扑克的视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 大片电影免费在线观看免费| 精品人妻在线不人妻| 中国国产av一级|