新疆藥桑中稀有黃酮桑根酮M的分離鑒定及其抗氧化活性分析

向 偉，喻 艷，劉 靜，谷少偉，徐 立,*，左少純，黃先智，蒲 彬

（1.西南大學生物技術學院，重慶 400716；2.新疆維吾爾自治區(qū)和田蠶?？茖W研究所，新疆 和田 848000）

新疆藥桑中稀有黃酮桑根酮M的分離鑒定及其抗氧化活性分析

向 偉1，喻 艷1，劉 靜1，谷少偉1，徐 立1,*，左少純2，黃先智1，蒲 彬2

（1.西南大學生物技術學院，重慶 400716；2.新疆維吾爾自治區(qū)和田蠶?？茖W研究所，新疆 和田 848000）

經(jīng)70%乙醇冷浸提取、不同溶劑萃取，在清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基活性跟蹤下，通過多次柱層析及薄層層析（thin layer chromatography，TLC），從藥桑枝條中分離得到一種稀有黃酮類化合物，經(jīng)波譜鑒定、結(jié)構分析確定其為桑根酮M（sanggenon M）。以人工合成的抗氧化劑二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）為對照進行抗氧化活性實驗，結(jié)果表明桑根酮M具有很好的抗氧化活性，其清除DPPH自由基和羥自由基（·OH）的IC50值分別為45.984 mg/L和65.692 mg/L（對照BHT的IC50值分別為64.189、231.556 mg/L），總還原力也明顯高于BHT。

藥桑枝條；桑根酮M；分離鑒定；黃酮；抗氧化活性

自由基是可以獨立存在的，至少包含一個未成對電子的物質(zhì)，具有高化學反應活性。其在正常細胞代謝中均能產(chǎn)生過量的自由基，能夠攻擊生物大分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等，同衰老及眾多疾病的發(fā)生密切相關[1-2]。目前各種抗氧化劑的研制已越來越受到人們的重視，而在人工合成抗氧化劑的安全性已受到質(zhì)疑的情況下，尋找食物源天然抗氧化成分已經(jīng)成為研究熱點[3-4]。

新疆藥桑屬于黑桑種（Morus nigra L.），作為新疆地區(qū)特殊的藥食兩用桑樹品種，其果實桑椹已被開發(fā)成多種商品，因其良好的藥理活性而深受消費者喜愛[5]。然而目前人們只食用其果實桑椹，大量的藥桑枝條卻未被充分利用。有研究表明，黑桑莖皮提取物的乙酸乙酯部分具有很好的抗氧化活性[6]，本實驗以藥桑枝條為原料，研究其提取物的抗氧化活性，并與人工合成的抗氧化劑二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）進行比較，旨在為藥桑枝條的開發(fā)利用及天然抗氧化成分的發(fā)現(xiàn)提供實驗基礎及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋季剪伐的新疆藥桑枝條，由新疆維吾爾自治區(qū)和田蠶桑科學研究所提供。

柱層析硅膠（80～100 目、200～300 目、H硅膠） 青島海洋化工有限公司；HSGF254薄層層析硅膠板（0.15～0.2 mm） 煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；Sephadex LH-20 美國Sigma公司；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均為工業(yè)級 重慶市鈦新化工有限公司；氯仿、甲醇、無水乙醇均為分析純 成都市科龍化工試劑廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

DLSB型低溫冷卻液循環(huán)泵、SHZ型循環(huán)水真空泵、20 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責任公司；Büchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；ARX-600、DRX-500核磁共振儀 德國Bruker公司；Auto Spec 3000質(zhì)譜儀 英國VG公司；iMark酶標儀 美國Bio-Rad公司；定制層析柱 重慶渝北亞新玻璃廠。

1.3 方法

1.3.1 化合物的分離純化及結(jié)構鑒定

將新疆藥桑枝條自然風干，粉碎，用70%乙醇冷浸的方式提取3 次，低溫減壓條件下濃縮至浸膏狀，再分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取并低溫減壓濃縮。劉靜等[7]研究表明，乙酸乙酯萃取部分對DPPH自由基的清除能力最強，故取此部分進行分離。將乙酸乙酯萃取部分用80～100 目硅膠拌樣后進行硅膠柱層析，層析柱為定制玻璃柱（25 cm×120 cm），用石油醚進行濕法裝柱，柱內(nèi)填充約55 cm高的80～100 目硅膠。分別用石油醚、乙酸乙酯、甲醇進行洗脫，洗脫部分通過薄層層析（thin layer chromatography，TLC）與DPPH自由基清除活性檢測相結(jié)合的分析方式，再輔以紫外顯色、10%硫酸-乙醇顯色等，根據(jù)相同或相近合并的原則進行歸類合并，得到6 個部分。取活性好的第1部分拌80～100 目硅膠，將層析柱（15 cm×130 cm）濕法填充約90 cm高的200～300 目硅膠，以石油醚-乙酸乙酯進行梯度洗脫，利用如上的合并方法和原則得到9 個部分。利用DPPH自由基顯色的薄層自顯影技術進行活性測定，將得到活性較好的第7部分以80～100 目硅膠拌樣后上H硅膠柱，柱子為定制玻璃層析柱（5 cm×60 cm），采用石油醚濕法裝柱，柱內(nèi)填充約40 cm高的H硅膠，以石油醚-乙酸乙酯進行梯度洗脫，洗脫液采用上述合并方法合并，合并后經(jīng)凝膠層析（Sephadex LH-20，乙酸乙酯柱）反復純化，之后通過制備TLC進行分離（層析液為石油醚-乙酸乙酯（3∶1，V/V）），回收板上Rf＝0.65左右處的黃色斑點硅膠，用甲醇洗脫并蒸干溶劑，最終得到化合物X。以四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS）為內(nèi)標，對化合物X進行波譜測定及結(jié)構解析。

1.3.2 化合物X清除DPPH自由基活性測定

參考周瑋婧等[8]的方法，取不同質(zhì)量濃度樣品液2 mL，與2×10－4mmol/L的DPPH甲醇溶液2 mL混合，37 ℃水浴30 min后于515 nm波長處測定其吸光度，對照組以等體積ddH2O代替樣品液，空白以等體積甲醇代替DPPH甲醇溶液。以人工合成抗氧化劑BHT為對照，設置3 個重復，按照下式計算化合物X的DPPH自由基清除率。

式中：A1為樣品組吸光度；A2為空白組吸光度；A3為對照組吸光度。

1.3.3 化合物X清除羥自由基（·OH）活性測定

參考王傳宏等[9]的方法，取1.5 mmol/L FeSO4溶液1.5 mL，與6 mmol/L H2O21 mL混合，37 ℃水浴30 min后，加入20 mmol/L水楊酸0.5 mL，同時加不同質(zhì)量濃度樣品液并用70%乙醇補齊至4 mL，再37 ℃水浴30 min，于562 nm波長處測定吸光度，以人工合成抗氧化劑BHT為對照，設置3 個重復。化合物X的·OH清除率按照文獻[9]的方法計算。

1.3.4 化合物X總還原力測定

參考劉靜等[7]的方法，取100 μL樣品液，依次加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和10 g/L的K3Fe(CN)6各1.0 mL，于50 ℃水浴20 min，快速冷卻并依次加入10 g/100 mL的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、蒸餾水、1 g/L的氯化鐵溶液各1.0 mL，每次添加后均混勻，靜置10 min后于700 nm波長處測定其吸光度。以人工合成抗氧化劑BHT為對照，設置3 個重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物X的理化性質(zhì)

化合物X為黃綠色黏稠液體，易溶于甲醇、乙酸乙酯，在GF-254硅膠板上用石油醚-乙酸乙酯（3∶1，V/V）進行TLC分析，在Rf＝0.75左右有一圓形斑點，該斑點在自然光下呈黃色，在254 nm及364 nm波長處顯暗斑，用10%硫酸-乙醇溶液噴灑，高溫烘烤后顯紅褐色，鹽酸-鎂粉反應呈橙色。由以上結(jié)果初步判斷化合物X可能為黃酮類化合物。

2.2 化合物X的光譜數(shù)據(jù)及結(jié)構解析

通過電子轟擊質(zhì)譜（electron impact mass spectrometry，EI-MS）得到化合物X的相對分子質(zhì)量為436，結(jié)合其核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）譜可推斷出化合物X的分子式為C25H24O7，結(jié)合其理化性質(zhì)及1H-NMR、13C-NMR、DEPT譜進行結(jié)構解析：δH1.51（3H，s，H-17）、1.63（3H，s，H-18）、6.35（1H，d，6，H-14）、5.58（1H，d，6，H-15）信號為一組二甲基苯并吡喃環(huán)，其中前兩個為端甲基信號，后兩個1H、d峰提示為雙鍵所在位置，且此環(huán)為二元取代。δH1.42（3H，s，H-12）、1.42（3H，s，H-13）、2.75（1H，dd，6、12，H-9）、3.11（1H，dd，6、12，H-9）、5.20（1H，m，H-10）為一組二甲基烯丙基信號，其中前兩個為兩個端甲基信號。δH5.74（1H，s，H-6）為黃酮A環(huán)質(zhì)子信號。δH6.47（1H，d，6，H-3’）、6.59（1H，d，12，H-5’）、7.28（1H，s，H-6’）為黃酮B環(huán)上3 個H信號。其波譜數(shù)據(jù)與文獻[10-11]的報道基本一致，故最終確定其為桑根酮M（sanggenon M），其波譜數(shù)據(jù)歸屬和結(jié)構分別如表1和圖1所示。

表1 桑根酮M的13C-NMR和1H-NMR譜數(shù)據(jù)Table 113C-NMR and1H-NMR spectral data of sanggenon M

圖1 桑根酮M的結(jié)構式Fig.1 Structure of sanggenon M

2.3 桑根酮M的DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除實驗被普遍用于物質(zhì)的抗氧化活性測試中[12]，由圖2可知，桑根酮M清除DPPH自由基的能力較對照BHT更強，通過統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0求出其IC50為45.984 mg/L（對照BHT的IC50為64.189 mg/L）。

圖2 桑根酮M清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH radical scavenging capacity of sanggenon M

2.4 桑根酮M的·OH清除活性

圖3 桑根酮M清除·OH的能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity of sanggenon M

·OH是機體內(nèi)主要的自由基并同眾多疾病的發(fā)生有關[13-15]，如圖3所示，桑根酮M對·OH的清除能力顯著高于對照BHT，但在60 mg/L（此時的·OH清除率為50%左右）以后，其清除能力隨質(zhì)量濃度的增大變化明顯減緩，通過統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0求出桑根酮M清除·OH的IC50為65.692 mg/L（對照BHT的IC50為231.556 mg/L）。

2.5 桑根酮M的總還原力

圖4 桑根酮M的還原力Fig.4 Reducing power of sanggenonM

還原力是化合物抗氧化能力的重要指標，由圖4可知，桑根酮M的總還原力明顯強于對照BHT。在20～40 mg/L時，其總還原力隨著質(zhì)量濃度的增大急劇增加，其后有一平緩期，然后再隨著質(zhì)量濃度的增大而有較大變化，這一變化過程的原因還有待進一步分析研究。

3 討 論

前人對桑根酮類物質(zhì)的研究主要集中在抗炎[16-18]、降血糖[19]、抗腫瘤[20]等活性方面，所分離得到桑根酮類物質(zhì)的部位均是桑根[10,18,21-22]，本研究從藥桑枝條中分離得到該物質(zhì)，并對其抗氧化活性進行了研究。桑根酮M清除DPPH自由基的能力強于人工合成抗氧化劑BHT，清除·OH能力及總還原能力顯著強于后者，這種來源于藥食兩用桑樹材料的化合物在天然抗氧化食品添加劑及保健品領域具有一定的應用前景。新疆的自然環(huán)境惡劣，該地區(qū)植物具有很強的抗旱能力，有研究報道[23-24]抗氧化能力同植株對嚴重干旱的耐受能力有一定關系，這可能是該物質(zhì)存在于藥桑這一桑種植物枝條中的原因之一?；谏涞纳硖匦裕貏e是在新疆干旱沙漠地區(qū)的生態(tài)環(huán)境的栽培管理特點決定了藥桑根的寶貴性，而桑枝條每年都可剪伐，資源豐富且目前未被利用，因此，在藥桑枝條中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)具有重要的現(xiàn)實意義。關于該物質(zhì)更多的生物活性還有待進一步研究。

[1] YOUNG I S, WOODSIDE J V. Antioxidants in health and disease[J]. Journal of Clinical Pathology, 2001, 54(3): 176-186.

[2] JAZAYERI A. The importance of antioxidants with the marine origin in inhibit free radicals[J]. Life Science Journal-Acta Zhengzhou University Overseas Edition, 2012, 9(2): 1128-1132.

[3] NACZK M, SHAHIDI F. Phenolics in cereals, fruits and vegetables: occurrence, extraction and analysis[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 41(5): 1523-1542.

[4] NETZEL M, NETZEL G, TIAN Q G, et al. Native Australian fruits: a novel source of antioxidants for food[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2007, 8(3): 339-346.

[5] 盧紅, 丁天龍, 吳曙光, 等. 新疆藥桑的藥用價值及在維吾爾醫(yī)藥中的應用[J]. 蠶業(yè)科學, 2011, 37(6): 1098-1101.

[6] WANG Lei, YANG Yan, LIU Chao, et al. Three new compounds from Morus nigra L.[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2010, 12(6): 431-437.

[7] 劉靜, 劉超, 王傳宏, 等. 新疆藥桑枝條醇提物不同溶劑萃取組分的抗氧化活性物質(zhì)含量及抗氧化活性測試[J]. 蠶業(yè)科學, 2013, 39(5): 978-983.

[8] 周瑋婧, 隋勇, 孫智達, 等. 荔枝皮原花青素與VC、VE的協(xié)同抗氧化研究[J]. 食品科學, 2012, 33(3): 5-8.

[9] 王傳宏, 劉超, 劉靜, 等. 新疆藥用植物黑桑的抗氧化性[J]. 林業(yè)科學, 2014, 50(8): 53-59.

[10] HANO Y, ITOH M, KOYAMA N, et al. Constituents of the Chinese crude drug Sāng-Bái-Pí (Morus root bark). V: structures of three new flavanones, sanggenons L, M, and N[J]. Heterocycles, 1984, 22(8): 1791-1800.

[11] NOMURA T, FUKAI T, HANO Y. Constituents of the Chinese crude drug “Sang-Bai-Pi” (Morus root bark)[J]. Planta Medica, 1983, 47(1): 30-34.

[12] DAWIDOWICZ A L, WIANOWSKA D, OLSZOWY M. On practical problems in estimation of antioxidant activity of compounds by DPPH center dot method (problems in estimation of antioxidant activity)[J]. Food Chemistry, 2012, 131(3): 1037-1043.

[13] MAURIZI C P. Alzheimer’s disease: roles for mitochondrial damage, the hydroxyl radical, and cerebrospinal fluid deficiency of melatonin[J]. Medical Hypotheses, 2001, 57(2): 156-160.

[14] PANDEY M, BORAH A, VARGHESE M, et al. Striatal dopamine level contributes to hydroxyl radical generation and subsequent neurodegeneration in the striatum in 3-nitropropionic acid-induced Huntington’s disease in rats[J]. Neurochemistry International, 2009, 55(6): 431-437.

[15] PENNATHUR S, WAGNER J D, LEEUWENBURGH C, et al. A hydroxyl radical-like species oxidizes cynomolgus monkey artery wall proteins in early diabetic vascular disease[J]. Journal of Clinical Investigation, 2001, 107(7): 853-860.

[16] CHEON B S, KIM Y H, SON K S, et al. Effects of prenylated flavonoids and biflavonoids on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production from the mouse macrophage cell line RAW 264.7[J]. Planta Medica, 2000, 66(7): 596-600.

[17] DAT N T, PHUNG T, LE T, et al. Sanggenon C and O inhibit NO production, iNOS expression and NF-κB activation in LPS-induced RAW264.7 cells[J]. Immunopharmacology and Immunotoxicology, 2012, 34(1): 84-88.

[18] ZELOVA H, HANAKOVA Z, CERMAKOVA Z, et al. Evaluation of anti-inflammatory activity of prenylated substances isolated from Morus alba and Morus nigra[J]. Journal of Natural Products, 2014, 77(6): 1297-1303.

[19] CUI L, NA M K, OH M, et al. Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors from Morus root bark[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2006, 16(5): 1426-1429.

[20] HUANG Hongbiao, LIU Ningning, ZHAO Kai, et al. Sanggenon C decreases tumor cell viability associated with proteasome inhibition[J]. Frontiers in Bioscience, 2011, 3: 1315-1325.

[21] SHI Y Q, FUKAI T, NOMURA T. Structure of sanggenon O, a dielsalder type adduct derived from a chalcone and a dehydroprenylated sanggenon-type flavanone from Morus cathayana[J]. Heterocycles, 2001, 54(2): 639-646.

[22] HANO Y, NOMURA T. Constituents of the Chinese crude drug“Sang-Bai-Pi” (Morus root barks). IV: structures of four new flavonoids, sanggenon H, I, J and K[J]. Heterocycles, 1983, 20(6): 1071-1076.

[23] LIU Changcheng, LIU Yuguo, GUO Ke, et al. Effect of drought on pigments, osmotic adjustment and antioxidant enzymes in six woody plant species in karst habitats of Southwestern China[J]. Environmental and Experimental Botany, 2011, 71(2): 174-183.

[24] WANG Shuncai, LIANG Dong, LI Chao, et al. Influence of drought stress on the cellular ultrastructure and antioxidant system in leaves of drought-tolerant and drought-sensitive apple rootstocks[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2012, 51: 81-89.

Separation, Identification and Antioxidant Activity of Rare Flavonoid Sanggenon M in Black Mulberry Grown in Xinjiang

XIANG Wei1, YU Yan1, LIU Jing1, GU Shaowei1, XU Li1,*, ZUO Shaochun2, HUANG Xianzhi1, PU Bin2
(1. College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. Hetian Sericultural Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Hetian 848000, China)

A rare flavonoid compound was obtained from black mulberry branches through extraction with 70% cold ethanol, fractionation by organic solvent extraction, column chromatography and thin-layer chromatography (TLC). The flavonoid was identified as sanggenon M by spectroscopic and structural analysis. Antioxidant activity of sanggenon M was evaluated in comparison with that of the synthetic antioxidant butylated hydroxytoluene (BHT). The IC50of sanggenon M for scavenging DPPH radical and hydroxyl radicals were 45.984 and 65.692 mg/L, respectively, compared to 64.189 and 231.556 mg/L for BHT. The total reducing power of sanggenon M was obviously higher than that of the control.

black mulberry branch; sanggenon M; separation and identification; flavonoid; antioxidant activity

Q946.8；O629.9

A

1002-6630（2015）21-0037-04

10.7506/spkx1002-6630-201521008

2015-01-13

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蠶桑）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-22-ZJ0503）；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金項目（XDJK2015C131）；重慶市研究生科研創(chuàng)新項目（CYS2015069）

向偉（1989—），男，碩士研究生，主要從事植物化學、桑樹病害等方面研究。E-mail：xiangwel@foxmail.com

*通信作者：徐立（1976—），男，副教授，博士，主要從事植物化學研究。E-mail：mulberry@swu.edu.cn