昆侖雪菊黃酮類化合物的抗氧化相互作用研究

丁 豪，楊海燕*，辛志宏

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

昆侖雪菊黃酮類化合物的抗氧化相互作用研究

丁 豪1,2，楊海燕1,*，辛志宏2,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

目的：選取昆侖雪菊中5 種具有強(qiáng)抗氧化活性的黃酮類化合物馬里苷、金雞菊噢、黃杉素、紫鉚因和奧卡寧，研究其抗氧化相互作用。方法：以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dinhenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力為指標(biāo)，采用Chou-Talalay中效原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分析抗氧化相互作用。結(jié)果：金雞菊噢與紫鉚因、黃杉素與紫鉚因之間具有抗氧化中等協(xié)同作用，它們對清除DPPH自由基的加權(quán)平均聯(lián)合作用指數(shù)（weighted average combination index，CIwt）值分別為0.824和0.749。另外，金雞菊噢與紫鉚因復(fù)配時(shí)，當(dāng)半抑制濃度（IC50）大于1且CIwt值小于0.90時(shí)，出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。3 種化合物聯(lián)合使用時(shí)，清除DPPH自由基的CIwt值均大于1，不存在協(xié)同抗氧化作用。結(jié)論：昆侖雪菊中黃酮類化合物之間的抗氧化相互作用關(guān)系與化合物的結(jié)構(gòu)和濃度有關(guān)。

黃酮類化合物；抗氧化；中效原理；相互作用

氧自由基是由機(jī)體氧化反應(yīng)產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，能破壞細(xì)胞內(nèi)DNA，加速人體衰老，導(dǎo)致癌癥的產(chǎn)生[1]。自由基導(dǎo)致衰老的加速，衰老又使得人體在“消滅”自由基方面的功能減弱，自由基和衰老使得人體的健康陷入了一個(gè)惡性循環(huán)。因此，及時(shí)消除機(jī)體內(nèi)過多的氧化自由基，能夠有效預(yù)防由自由基引發(fā)的一系列疾病，如癌癥、動(dòng)脈硬化、糖尿病、心血管病等[2]。天然抗氧化劑與人工合成的抗氧化劑相比，具有安全、無毒、高效等特點(diǎn)，而復(fù)合抗氧化劑相比于單一抗氧化劑不僅抗氧化活性提高[3]，而且降低了成本，還可以避免因抗氧化劑使用過多從而帶來安全問題，具良好的應(yīng)用前景。許多研究表明，植物的強(qiáng)抗氧化能力并非單個(gè)化合物作用的結(jié)果，而是由多個(gè)化合物共同作用產(chǎn)生的[4]，因而對于多種抗氧化劑協(xié)同抗氧化作用的研究已成為天然抗氧化劑的研究熱點(diǎn)。不同抗氧化劑的協(xié)同抗氧化作用的研究已有報(bào)道，如麥苗中阿魏酸、抗壞血酸、總黃酮兩兩復(fù)配顯示協(xié)同抗氧化作用[5]，白藜蘆醇與黑木耳多糖具有協(xié)同抗氧化作用[6-7]，荔枝皮原花青素與VC、VE存在協(xié)同抗氧化作用[8]，茶多酚與幾種天然抗氧化物質(zhì)之間存在協(xié)同抗氧化作用[9-10]，VC、VE對鷹嘴豆抗氧化多肽的抗氧化能力具有顯著增效作用[11]，花椒葉提取物與VC、檸檬酸具有協(xié)同增效作用[12]，咖啡渣提取物與VC、檸檬酸存在協(xié)同抗氧化作用等[13]。目前，黃酮類化合物的抗氧化能力已被科學(xué)界廣泛接受[14]，雪菊提取物中分離純化的黃酮類化合物的抗氧化作用也有初步的研究[15-16]，但關(guān)于它們之間協(xié)同抗氧化作用的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)是在研究雪菊中分離純化的幾個(gè)黃酮類化合物的基礎(chǔ)上，將其相互組合，探討它們之間抗氧化活性的相互作用，以期篩選出協(xié)同抗氧化作用的最佳組合，為深入研究昆侖雪菊抗氧化活性奠定基礎(chǔ)，也為開發(fā)復(fù)合型天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊（購于新疆烏魯木齊北園春批發(fā)市場）中分離純化得到的5 種黃酮類化合物，經(jīng)譜學(xué)方法分別鑒定為馬里苷（化合物1）、金雞菊噢（化合物2）、黃杉素（化合物3）、紫鉚因（化合物4）和奧卡寧（化合物5）[17]；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、α-生育酚 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2102C/PC/PCS型分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除法參照Alvarez-Jubete等[18]，并稍作修改。0.2 mmol/L DPPH溶液用乙醇配制，吸取2.0 mL DPPH溶液分別與2.0 mL不同濃度的化合物溶液混合，室溫避光放置30 min，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，517 nm波長處測定吸光度（A517nm）。清除率計(jì)算見公式（1）。

式中：A空白為加入DPPH溶液與無水乙醇的A517nm值；A樣品為DPPH溶液與樣品溶液的A517nm值；A對照為樣品溶液與無水乙醇的A517nm值。

1.3.2 抗氧化活性的測定

將5 種化合物分別配制為濃度2.5、5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、40、60、80、100 μmol/L的溶液，測定其DPPH自由基清除率，根據(jù)所得清除率曲線計(jì)算出半抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）。以α-生育酚為陽性對照組。

1.3.3 抗氧化相互作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以5 種化合物各自的IC50（μmol/L）為基礎(chǔ)，每種化合物分別配制濃度為0.1 IC50（即0.1×IC50，下同）、0.2 IC50、0.3 IC50、0.4 IC50、0.5 IC50、0.75 IC50、1.0 IC50、1.25 IC50、1.5 IC50的溶液。兩種化合物復(fù)配，各個(gè)濃度均以體積比1:1混合均勻（如：1 mL 0.1 IC50的化合物1與1 mL 0.1 IC50的化合物2混合），測定其DPPH自由基清除率[19-20]。3 種化合物復(fù)配，各個(gè)濃度以體積比1∶1∶1混合均勻（如0.67 mL 0.1 IC50的化合物1與0.67 mL 0.1 IC50的化合物2及0.67 mL 0.1 IC50的化合物3混合），按1.3.1節(jié)方法測定復(fù)合組分的抗氧化活性。

1.3.4 中效原理

采用Chou-Talalay的中效原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，研究5 種黃酮類化合物之間的相互作用?？捎萌缦鹿奖硎荆?/p>

式中：fa為反應(yīng)系統(tǒng)中D濃度所產(chǎn)生效應(yīng)的部分；fu為未產(chǎn)生效應(yīng)的部分；fu＝1－fa；D為藥物濃度/（mol/L）；Dm為中效濃度/（mol/L）；m為中效曲線斜率。

兩邊取對數(shù)，即

設(shè)Y＝lg（fa/fu），X＝lgD，b＝m，a＝mlgDm，可得線性方程式：

藥物聯(lián)合作用指數(shù)（combination index，CI）的一般式為：

其中兩藥物聯(lián)合作用指數(shù)的公式為：

式中：D1和D2分別為藥物1與2聯(lián)合作用產(chǎn)生x效應(yīng)時(shí)各自所需濃度/（mol/L）；Dx1和Dx2為藥物1和2單用產(chǎn)生x效應(yīng)時(shí)各自所需濃度/（mol/L）[21]，通過CI值的大小可以定量判斷藥物間相互作用的性質(zhì)以及強(qiáng)度，詳見表1。用于衡量綜合相互作用的加權(quán)平均CI（weighted average CI，CIwt）值的一般式為：

式中：CI50表示在達(dá)到中效劑量，即50%作用濃度（50% effect concentration，EC50）時(shí)候的CI值，CI75、CI90、CI95同理[22]。

表1 藥物聯(lián)合作用的CI值區(qū)間及評價(jià)Table 1 Average CI and description in drug combination studies

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種化合物的抗氧化活性

圖1 5種化合物的DPPH自由基清除效果Fig.1 DPPH radical scavenging effects of five compounds

由圖1可知，馬里苷、金雞菊噢、黃杉素、紫鉚因和奧卡寧的IC50分別為28.33、34.35、41.69、30.81、38.72 μmol/L，而對照組α-生育酚的IC50為27.07 μmol/L，說明這5 種化合物對DPPH自由基清除能力略弱于α-生育酚，且馬里苷（化合物1）的抗氧化能力強(qiáng)于其他4 種化合物。圖2則是本實(shí)驗(yàn)所選取的5 種黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及黃酮的基本結(jié)構(gòu)。

圖2 5種化合物的結(jié)構(gòu)及黃酮類物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of five compounds and basic structure of flavonoids

2.2 5 種化合物兩兩復(fù)合物的抗氧化活性

圖3 兩化合物組合的DPPH自由基清除率和濃度關(guān)系Fig.3 Relationship of DPPH free radical clearance and concentrations of two flavonoid compounds in combination

由圖3可知，化合物兩兩組合時(shí)，除了化合物2+4和化合物3+4以外，其他8 組聯(lián)合使用清除DPPH自由基的清除率都小于它們各自單個(gè)化合物的清除率。

圖4 5種化合物的聯(lián)合作用指數(shù)Fig.4 CI-effect plots for five compounds in combination

由圖4F可知，化合物2+4在半抑制濃度為0.1 IC50、0.2 IC50、0.3 IC50、0.4 IC50、0.5 IC50、0.75 IC50、1.0 IC50、1.25 IC50、1.5 IC50時(shí)，其CI值分別為0.91、0.95、0.95、1.02、1.03、1.00、1.00、0.85、0.65。由此可見，在半抑制濃度＜1.0 IC50的時(shí)候，CI值在0.90～1.10內(nèi)，表明是相加效應(yīng)；當(dāng)半抑制濃度＞1.0 IC50時(shí)，CI值＜0.90，說明兩化合物之間具有協(xié)同抗氧化作用。化合物3+4在半抑制濃度為0.1 IC50、0.2 IC50、0.3 IC50、0.4 IC50、0.5 IC50、0.75 IC50、1.0 IC50、1.25 IC50、1.5 IC50時(shí)，其CI值分別為1.00、0.93、0.95、0.94、1.00、0.95、0.88、0.79、0.67，各半抑制濃度下的CI值均≤1，說明這兩個(gè)化合物具有協(xié)同抗氧化作用（圖4H）。其中，圖4F、4H的CI值曲線在判別線（CI＝1.0）的下方，說明化合物2+4和化合物3+4之間存在協(xié)同作用；圖4A、4B、 4E、4I的CI值≈1，表現(xiàn)為相加效應(yīng)；圖4C、4D、4G、4J的CI值曲線在判別線上方，即CI值＞1，說明這幾個(gè)組合之間存在拮抗作用。

表2 兩化合物復(fù)配清除DPPH自由基的CI值Table 2 CI values of combinations two flavonoid compounds for scavenging DPPH free radical

由表2可知，化合物2+4、3+4時(shí)的CIwt值分別為0.824、0.749，表現(xiàn)為中等協(xié)同作用，且協(xié)同效果后者略大于前者；同樣，化合物1+2、1+3、1+4、化合物2+3、化合物4+5分別組合時(shí)的CIwt值分別為1.038、1.006、1.090、0.979、1.004，全部位于0.90～1.10之間，說明兩兩之間存在相加作用；另外，化合物1+5，化合物2+5的CIwt值分別為1.273、1.367，位于1.20～1.45之間，說明兩兩之間存在中等拮抗作用；化合物3+5組合時(shí)的CIwt值為1.103，略大于1.10，說明兩化合物之間存在輕微拮抗作用。

2.3 5 種化合物三者復(fù)合物的抗氧化活性

表3 3種化合物復(fù)配清除DPPH自由基的CI值Table 3 CI values of combinations of three flavonoid compounds for scavenging DPPH free radical

由表3可知，3 種化合物復(fù)合使用時(shí)，除了化合物1、2、3復(fù)配和1、3、4復(fù)配時(shí)的CIwt值在1.00～1.10區(qū)間表現(xiàn)為相加作用，其余8 組組合的CIwt值均大于1.10，表現(xiàn)出不同程度的拮抗作用。其中CIwt最高的組合為化合物1+2+4，說明其抗氧化拮抗作用相對于其他組合較強(qiáng)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選取昆侖雪菊中5 種黃酮類化合物作為研究對象，包括馬里苷（化合物1）、金雞菊噢（化合物2）、黃杉素（化合物3）、紫鉚因（化合物4）和奧卡寧（化合物5），以DPPH自由基清除能力為評價(jià)指標(biāo)，簡單易行，靈敏可靠，并采用Chou-Talalay中效原理分析化合物之間的相互作用，具有科學(xué)依據(jù)。

3.1 結(jié)構(gòu)的影響

影響黃酮類化合物抗氧活性的因素，最主要的是羥基化的程度和羥基的位置[23]。研究表明，黃酮結(jié)構(gòu)中，B環(huán)鄰二羥基、2,3-雙鍵與4-羰基、以及3,5-羥基是決定黃酮類化合物自由基清除活性的重要因素，一般認(rèn)為B環(huán)中的鄰二羥基對黃酮類化合物的抗氧活性起主要作用[24]。實(shí)驗(yàn)所選的5 種昆侖雪菊黃酮類化合物都具有3’,4’-二羥基結(jié)構(gòu)（圖2），因此，它們都具有較高的自由基清除能力（圖1）。但是，當(dāng)黃酮化合物兩兩復(fù)配和三者復(fù)配后，混合物的自由基清除能力卻多數(shù)呈相加和拮抗作用（表2、3），僅兩組具有協(xié)同作用（化合物2+4、化合物3+4）。Samra等[25]的研究表明，若兩種黃酮均有3’,4’-二羥基結(jié)構(gòu)，則混合物經(jīng)反應(yīng)后，由于2 種黃酮均生成鄰二苯醌結(jié)構(gòu)，混合物抗氧化活性受到較強(qiáng)抑制。三者復(fù)配的實(shí)驗(yàn)結(jié)果突出表明3’,4’-二羥基結(jié)構(gòu)對多黃酮化合物復(fù)配抗氧化活性的抑制作用（表3）。

除此之外，Choueiri等[26]發(fā)現(xiàn)，槲皮素與兒茶素混合后易成為氧化強(qiáng)化劑，增強(qiáng)活性氧類物質(zhì)（reactive oxygen species, ROS）的作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性。Hidalgo等[27]認(rèn)為，槲皮素、異槲皮素與花青素混合后，由于二者間發(fā)生氫鍵締合，減少了羥基數(shù)目，降低了供電子能力，從而削弱了與DPPH自由基的反應(yīng)能力。Meyer等[28]的研究結(jié)果表明，表兒茶素與具有4-羰基結(jié)構(gòu)的黃酮混合后，兒茶素、表兒茶素的鄰二酚羥基可與羰基發(fā)生氫鍵締合，阻礙兒茶素、表兒茶素的供氫能力，從而降低黃酮混合物的抗氧化性。由此可見，昆侖雪菊5 種黃酮類化合物復(fù)配清除DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)多數(shù)呈相加和拮抗作用的原因是5 種黃酮化合物都具有4-羰基結(jié)構(gòu)，相互混合以后，鄰二酚羥基可與羰基發(fā)生氫鍵締合，阻礙了其供氫能力，導(dǎo)致混合物缺少能夠中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的氫電子，從而降低DPPH自由基清除能力。

3.2 濃度的影響

有研究表明抗氧化物質(zhì)之間的協(xié)同抗氧化作用與抗氧化物質(zhì)的濃度有關(guān)[29]?；衔飪蓛蓮?fù)配清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在不同濃度下，有的混合物DPPH自由基清除能力比兩種化合物各自的清除能力都高，有的高于其中一個(gè)，也有的比兩種化合物都低，表明化合物濃度對昆侖雪菊黃酮類化合物復(fù)配的抗氧化活性有很大影響（圖3）。另外，不同DPPH自由基清除效果時(shí)，CI值也存在較大差異（圖4），說明作用效果對昆侖黃酮類化合物的相互作用關(guān)系有影響。由此推測，昆侖雪菊黃酮類化合物的抗氧化相互作用與化合物濃度有關(guān)。王岳飛等[9]研究了茶多酚與幾種天然抗氧化物質(zhì)的協(xié)同作用，研究結(jié)果也表明，抗氧化物質(zhì)之間的協(xié)同抗氧化作用與抗氧化物質(zhì)本身的抗氧化能力、抗氧化物質(zhì)有效濃度的高低等因素有關(guān)。孫世利等[10]研究茶多酚與VC、VE的協(xié)同抗氧化作用，結(jié)果表明，高濃度的茶多酚與VC、VE存在很好的協(xié)同抗氧化效應(yīng)。因此，選擇合適的復(fù)配濃度可以有效地降低昆侖雪菊黃酮類化合物之間的拮抗作用，或者增強(qiáng)其協(xié)同作用。

3.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的有關(guān)研究

對黃酮類化合物體外抗氧化活性的評價(jià)取決于DPPH自由基的性質(zhì)以及反應(yīng)機(jī)理，而這些機(jī)理又受到黃酮羥基的數(shù)量、位置、甲基化基團(tuán)、糖基化結(jié)構(gòu)、反應(yīng)試劑的結(jié)構(gòu)與極性等因素影響[30]。然而，除了體外抗氧化活性評價(jià)，更全面研究黃酮化合物的抗氧化相互作用還需要進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究黃酮混合物抗氧化活性的生物反應(yīng)。Rossetto等[31]以抗亞油酸氧化為評價(jià)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，兒茶素可促進(jìn)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等花青素的氫再生，從而提高混合物的抗氧化能力。Pignatelli等[32]則通過人體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兒茶素與槲皮素混合物能顯著抑制血小板聚集，從而顯著抑制膠原質(zhì)引起的過氧化氫的產(chǎn)生。因此，昆侖雪菊黃酮類化合物的體內(nèi)抗氧化相互作用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

昆侖雪菊中含有很多強(qiáng)抗氧化活性的黃酮類化合物，它們的抗氧化活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)也對黃酮混合物的抗氧化活性有很大影響。而且黃酮混合物的抗氧化相互作用關(guān)系跟黃酮化合物的復(fù)配濃度有關(guān)，合適的復(fù)配濃度可以增強(qiáng)協(xié)同作用，或降低拮抗作用。但由于昆侖雪菊中的黃酮類化合物種類繁多，并且相互作用的機(jī)理研究尚不十分明確，因此，對更多種類黃酮化合物的相互作用研究將是下一步的研究方向。此外，隨著體內(nèi)抗氧化活性評價(jià)體系的日益完善，昆侖雪菊黃酮類化合物的體內(nèi)抗氧化活性及其相互作用研究也將成為其抗氧化相互作用的研究重點(diǎn)。與此同時(shí)，進(jìn)一步研究黃酮類化合物的抗氧化相互作用，將為開發(fā)昆侖雪菊復(fù)合型天然抗氧化劑提供重要依據(jù)。

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Antioxidant Interaction of Flavonoids from Coreopsis tinctoria Nutt.

DING Hao1,2, YANG Haiyan1,*, XIN Zhihong2,*
(1. College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Objective: To study the interaction of five powerful antioxidant flavonoids isolated from Coreopsis tinctoria Nutt. including marein, maritimetin, taxifolin, butein and okanin. Methods: The DPPH scavenging capacity was used as the indicator of antioxidant activity, and Chou-Talalay method was used to analyze antioxidant interactions among these flavonoids. Results: There was moderate synergistic antioxidant interaction between maritimetin and butein, and between taxifolin and butein with weighed average combination index (CIwt) values of 0.824 and 0.749 for scavenging 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical, respectively. In addition, the IC50for maritimetin combined with butein was higher than 1, and the CIwtvalue was less than 0.90, suggesting an obvious synergistic interaction. Nevertheless, a combination of maritimetin, butein and taxifolin scavenged DPPH free radical with a CI value of higher than 1.0, indicating no synergistic interaction among these three antioxidants. Conclusion: The structure and concentration of flavonoids from Coreopsis tinctoria Nutt. can influence their antioxidant interaction.

flavonoids; antioxidant; Chou-Talalay method; interaction

TS201.2

A

1002-6630（2015）21-0026-07

10.7506/spkx1002-6630-201521006

2015-01-31

烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（Y121120008）；國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260377）

丁豪（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取與利用。E-mail：943880577@qq.com

*通信作者：楊海燕（1962—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取與利用。E-mail：yanghaiyan163@163.com

辛志宏（1974—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與化學(xué)。E-mail：xzhfood@njau.edu.cn