犬弓首蛔蟲卵卵殼裂解方法研究

犬弓首蛔蟲卵卵殼裂解方法研究

繁 萍1,2，楊衛(wèi)霞2，仁措卓瑪2，劉 斌2，白玲英2，張瑞強(qiáng)2*，康 明2

(1.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100083；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016)

摘要[目的] 為犬弓首蛔蟲卵殼的鑒定奠定基礎(chǔ)。[方法] 采用3種聯(lián)合作用方法對(duì)犬弓首蛔蟲卵殼進(jìn)行裂解，提取蟲卵基因組DNA，然后用犬弓首蛔蟲的ITS2特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。[結(jié)果] DNA提取試劑對(duì)蟲卵卵殼的作用不明顯，PCR擴(kuò)增結(jié)果未見預(yù)期片段；凍融后抽提DNA對(duì)蟲卵卵殼有一定作用，但大多數(shù)蟲卵還保留基本形態(tài)，PCR擴(kuò)增結(jié)果也未見預(yù)期片段；凍融15次+蛋白酶K消化2次過夜，然后抽提DNA，蟲卵大多數(shù)被裂解，利用PCR擴(kuò)增到目的片段。[結(jié)論] 破壞犬弓首蛔蟲卵的卵殼采用凍融+蛋白酶K消化的聯(lián)合方式效果明顯，關(guān)鍵因素是作用時(shí)間。

關(guān)鍵詞犬弓首蛔蟲卵；卵殼裂解；DNA抽提

中圖分類號(hào)S852.7

作者簡介繁萍(1975-)，女，山西大同人，講師，碩士，從事分子遺傳學(xué)研究。*

收稿日期2015-05-29

Study on the Cracking Method ofToxocaracanisEggshell

FAN Ping1,2，YANG Wei-xia2, RENCUO Zhuoma2, ZHANG Rui-qiang2*et al (1. School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100083; 2. College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining, Qinghai 810016)

Abstract[Objective] The research aimed to lay the foundation for the identification of Toxocara canis eggshell. [Method] The eggshell of T.canis was cracked by using three combined methods to extract genomic DNA from T.canis eggs. And ITS2 specific primers of T.canis were used for PCR amplification. [Result] The cracking effects of T.canis eggshell by using DNA extracting agent was not obvious, and target fragment wasn’t seen after PCR. The method of extracting DNA after freeze-thawing had some cracking effects on T.canis eggshell, but most of eggshells still remained the original forms and target fragment wasn’t seen after PCR. DNA was extracted from T.canis eggshell after they were frozen-thawed for 15 times and digested with protease K, then overnight. By using this method, most eggshells were cracked and target fragment was seen after PCR. [Conclusion] The method of freeze-thawing and digesting with protease K had obvious cracking effects on T.canis eggshell, and its key factor was action time.

Key wordsToxocaracaniseggs; Cracking of eggshell; DNA extraction

犬弓首蛔蟲是寄生于犬科的蛔蟲，與貓科動(dòng)物的蛔蟲都屬于弓首屬(Toxocara)和弓蛔屬(Toxascaris)[1]。弓首蛔蟲是一種人獸共患的寄生蟲[2]，它們的幼蟲可以進(jìn)入非特異宿主(包括人類)的組織中，引起幼蟲移行癥，在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義[2]。

寄生線蟲區(qū)別于原蟲，在進(jìn)行分子生物學(xué)研究中蟲體可用作研究材料[3-9]，少見采用蟲卵。這主要是因?yàn)橄x卵作為研究材料的工作會(huì)相對(duì)復(fù)雜，例如胃腸道內(nèi)容物或糞便中的蟲卵，常常需要經(jīng)過純化的過程才能保證后續(xù)結(jié)果的正確穩(wěn)定等。吳紹強(qiáng)等[10]研究表明有2份經(jīng)過改良的漂浮法初步純化到犬弓首蛔蟲卵液。為了進(jìn)一步鑒定蟲卵的正確性，筆者采提取蟲卵基因組DNA，然后用文獻(xiàn)報(bào)道的犬弓首蛔蟲的ITS2特異性引物[7-8]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本及來源。2份經(jīng)過初步純化濃縮的疑似犬弓首蛔蟲卵液，編號(hào)分別為T.-XN-1和T.-XN-2。

1.1.2試劑。基因快速檢測試劑盒、瓊脂糖、核酸熒光染料、6×Loading buffer，均購自天根生物公司。

1.2方法

1.2.1 蟲卵卵殼裂解方案。①方案1：將裝有蟲卵液的離心管在液氮罐中放置5 min，然后迅速移入預(yù)加熱至56 ℃的恒溫水浴箱中水浴5 min，將此過程重復(fù)15次；經(jīng)過凍融的含蟲卵液離心管中加入20 μl蛋白酶水，56 ℃水浴24 h，然后用基因快速檢測試劑盒提取基因組DNA，并擴(kuò)增目的片段；②方案2：重復(fù)方案1中的凍融過程3次，加入蛋白酶水，水浴過夜，其他操作同方案1；③方案3：凍融過程同方案2，不經(jīng)過蛋白酶K作用，直接提取DNA并擴(kuò)增檢測；④方案4：直接提取DNA并擴(kuò)增檢測。

1.2.2 蟲卵卵殼裂解效果的檢測。

1.2.2.1 基因組DNA抽提與目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增。DNA抽提和PCR檢驗(yàn)采用試劑盒，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2.2 殘余沉淀顯微鏡檢。將提取完DNA后的沉淀重懸，滴于載玻片上，顯微鏡100倍鏡檢，拍照記錄結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取裂解液對(duì)蟲卵的裂解效果按照基因快速檢測試劑盒說明書提取DNA后的沉淀，加入少量生理鹽水重懸鏡檢，可見到很多已經(jīng)去掉卵殼但未破壞卵膜的形態(tài)存在(圖1)。同時(shí)，用弓首蛔蟲ITS序列的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，也沒有獲得預(yù)期結(jié)果。這說明提取DNA所用的裂解液與10 000 r/min離心聯(lián)合作用對(duì)蟲卵的裂解效果不佳。

2.2凍融對(duì)蟲卵的裂解效果用凍存管盛裝蟲卵液，在液氮中冷凍5 min，再56 ℃水浴5 min,重復(fù)3～5次。涂片鏡檢。從圖2可以看出，蟲卵基本保持原有形態(tài)，大多數(shù)蟲卵出現(xiàn)空泡，說明凍融具有一定的作用，但試驗(yàn)中的方法還沒有達(dá)到有效裂解卵殼的程度，說明增加重復(fù)次數(shù)可能會(huì)增加裂解效果。

2.3凍融+蛋白酶K消化過夜處理基于以上試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)裂解方案改進(jìn)進(jìn)行:凍融(重復(fù)15次)+蛋白酶K消化過夜。從圖3可以看出，仍然有許多蟲卵未充分裂解，但可見到明顯的蟲卵碎片和破裂的蟲卵，說明改進(jìn)方法能有效裂解蟲卵。同時(shí)，利用裂解后的蟲卵液提取DNA，進(jìn)行ITS片段擴(kuò)增，電泳圖譜中可見大小約650 bp的片段(圖4)。

3討論

(1)分離蟲卵基因組DNA，首先要有充分裂解蟲卵外殼和卵膜的有效方法?；紫x蟲卵往往有堅(jiān)硬的卵殼，裂解工作尤為重要。實(shí)際用于裂解卵殼的作用方式包括化學(xué)試劑裂解、凍融、蛋白酶K消化和高速離心等。其中，化學(xué)試劑裂解是分離DNA的必需步驟，所有差別分組中都相同，視作平行穩(wěn)定因素，可以予以忽略。高速離心對(duì)普通細(xì)胞的作用相對(duì)明顯，DNA提取試劑裂解后經(jīng)過10 000 r/min離心10 min的沉淀涂片鏡檢結(jié)果，2種方式連續(xù)處理后的卵仍然不能很好裂解，說明采用的高速離心對(duì)蛔蟲卵殼的作用極弱。這也表明發(fā)揮主要作用的是凍融與蛋白酶K消化。

(2)該研究中在裂解蟲卵中發(fā)揮主要作用的因素是凍融聯(lián)合蛋白酶K后篩選凍融的重復(fù)次數(shù)和蛋白酶K的消化時(shí)間。在保證蟲卵液完全融解和結(jié)冰的情況下，凍融的重復(fù)次數(shù)越多，裂解效果越好。蛋白酶K的消化時(shí)間越長，裂解效果同樣越好。但是，研究工作的目的是進(jìn)行后續(xù)的核酸研究工作，因此保證核酸的質(zhì)量是必要的前提之一，也就是說，必須在最短的操作時(shí)間內(nèi)獲得高質(zhì)量的核酸。據(jù)報(bào)道，凍融重復(fù)次數(shù)20次[10]，聯(lián)合蛋白酶K消化24 h可以充分裂解蛔蟲卵。筆者試驗(yàn)了3種蟲卵卵殼裂解方案，方案1和方案3的效果不理想，方案2則最終擴(kuò)增到大小理想的核酸片段，基于研究中采用的引物是針對(duì)犬弓首蛔蟲的特異性鑒定引物，可以認(rèn)為方案2是該研究中理想的蟲卵裂解方式。

4結(jié)論

大多數(shù)生物學(xué)試劑公司都有成熟的提取基因組DNA的試劑盒，主要的應(yīng)用對(duì)象為常見生物。對(duì)于那些不屬于常見生物的樣本，因其特有的生物結(jié)構(gòu)和組成，常規(guī)的方法可能并不適用，這就需要通過改進(jìn)現(xiàn)有的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。筆者通過將常見技術(shù)聯(lián)合起來并適當(dāng)增加工作時(shí)間，在犬弓首蛔蟲卵卵殼的裂解上摸索出一個(gè)相對(duì)簡便的方法。采用這種摸索試驗(yàn)的方式，有利于更多的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物膜殼的裂解和基因組DNA的獲取。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱興全.小動(dòng)物寄生蟲病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

[2] 唐仲璋,唐崇惕.人獸線蟲學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[3] 梁軒,劉毅.犬弓首蛔蟲線粒體cox1基因的克隆及序列分析[J].中國動(dòng)物檢疫，2015(3)：112-115.

[4] 馬光旭,朱宏宏,胡鈴.犬弓首蛔蟲性別相關(guān)基因Tc-vit、Tc-iom、Tc-tpk、Tc-stp在不同生殖器官中的差異表達(dá)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015(3)：119-124.

[5] 李廣生,張瑩,盛中華.獅體內(nèi)蛔蟲的分子生物學(xué)鑒定[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2012(6)：26-28.

[6] 吳昌義,李冰,喬進(jìn)平.豬蛔蟲線粒體cox3基因部分序列的比較分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2011(1)：60-62.

[7] 王培園,陳武,賀現(xiàn)輝.棕蓑貓蛔蟲ITS及5.8S rDNA序列的克隆與分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2010(10)：1013-1016.

[8] 王培園,陳武,賀現(xiàn)輝.華南虎蛔蟲ITS及5.8S rDNA序列擴(kuò)增及分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42(9)：74-76.

[9] 周榮瓊,夏慶友,黃漢成,等.犬弓首蛔蟲ITS1基因的克隆及序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32(10)：818-820.

[10] 吳紹強(qiáng)，林祥梅，韓雪清，等.泡菜中蛔蟲卵熒光PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2007，28(11)：345-349.