玉米內(nèi)州萎蔫病菌LAMP快速檢測方法的建立

玉米內(nèi)州萎蔫病菌LAMP快速檢測方法的建立

單長林1，李雪松1，李孝軍1，周 圓1，楊賽軍1，王 健1,張建成2

(1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局,浙江舟山 316000；2.嘉興出入境檢驗(yàn)檢疫局,浙江嘉興 314000)

摘要[目的] 建立玉米內(nèi)州萎蔫病菌的快速恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)。 [方法]利用GenBank公布的玉米內(nèi)州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis，Cmn) 16S-23S序列設(shè)計(jì)LAMP (loop-mediated isothermal amplification)引物，建立玉米內(nèi)州萎蔫病菌LAMP檢測體系，并對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。[結(jié)果]LAMP 在內(nèi)引物、環(huán)化引物和外引物比為6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)的25 μl體系下64 ℃反應(yīng)30 min為最佳反應(yīng)條件，且LAMP引物能從供試的7種菌株中特異性擴(kuò)增出Cmn 梯度性條帶。以玉米內(nèi)州萎蔫病菌基因組和菌懸液梯度稀釋液為模板檢測LAMP體系的靈敏度，結(jié)果顯示，LAMP檢測體系針對基因組和菌懸液的靈敏度分別達(dá)到了50 fg和3.6 CFU，比普通PCR靈敏度高100倍。[結(jié)果]LAMP檢測體系簡單、快速、靈敏度高、特異性好，在玉米內(nèi)州萎蔫病菌檢測方面潛力巨大。

關(guān)鍵詞玉米內(nèi)州萎蔫病菌；LAMP；檢測

中圖分類號S188

基金項(xiàng)目浙江檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目(ZK201227);浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2009C12054)；浙江省科技廳公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2013C32002)。

作者簡介單長林(1987-)，男，山東單縣人，農(nóng)藝師，碩士，從事進(jìn)出境動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫工作。

收稿日期2015-06-05

The Establishment of a Rapid Detection Method ofClavibactermichiganensissubsp.nebraskensisLAMP

SHAN Chang-lin,LI Xue-song，LI Xiao-jun et al (Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan, Zhejiang 316000)

Abstract[Objective]The aim was to establish a rapid detection method of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis LAMP. [Method] The LAMP primers was designed by the rRNA 16S-23S of the genome of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, were verified using Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis and other non-target strains. [Result]The data showed that the optimal amplification condition was at 64 ℃ for 30 min with 30 pmol of F3(B3), 20 pmol of LF(LB) and 5 pmol of FIP(BIP). Both the sensitivity and the specificity of the LAMP assay developed in the study were excellent. The detection limit of the LAMP was as low as 50 fg ( for DNA) and 3.6 CFU (for bacteria) per reaction. Compared with conventional PCR method, the LAMP assay developed in this study was more specific and more sensitive. Therefore, the LAMP method could be considered as an effective tool for the rapid screening of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis. [Conclusion] The study showed that the loop-mediated isothermal amplification(LAMP) could be used as a reliable, rapid and simple method for detection of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis (Cmn) causing Goss’s Bacterial Wilt and Leaf Blight of Corn.

Key wordsClavibactermichiganensissubsp.nebraskensis; LAMP; Detection

玉米內(nèi)州萎蔫病(Goss’s Bacterial Wilt and Leaf Blight of Corn)是由執(zhí)安棒形桿菌內(nèi)布拉斯加亞種(Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis,Cmn)引起的一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，可導(dǎo)致玉米產(chǎn)量損失率高達(dá)50%[1]。自1969年首次發(fā)現(xiàn)于內(nèi)布拉斯加州中部[2],該病通過種子傳帶進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播[3]，目前已擴(kuò)散至美國多州和加拿大部分地區(qū)[4-6]，在我國尚未發(fā)現(xiàn)。玉米在我國的播種面積和產(chǎn)量均居世界第二位[7]，而且我國大部分玉米種植區(qū)適合Cmn的發(fā)生與傳播[8]，該病菌一旦傳入，將嚴(yán)重威脅我國糧食生產(chǎn)安全，因此預(yù)防和控制玉米內(nèi)州萎蔫病，對確保玉米生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展具有極為重要的意義。

Cmn為革蘭氏陽性，不產(chǎn)孢，不固酸，嚴(yán)格好氧性，隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)厚壁菌綱(Firmibacteria)棒型桿菌屬(Clavibacter)。目前針對其檢測方法主要有分離培養(yǎng)法[9-10]、血清學(xué)檢測[11-13]和分子生物學(xué)檢測[14-18]等方法，分離培養(yǎng)法和血清學(xué)檢測方法操作復(fù)雜、耗時(shí)較長且靈敏度較低不適合快速檢測。分子生物學(xué)檢測方法具備快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，但其檢測過程需PCR儀等設(shè)備支持，無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場操作。2000年，日本學(xué)者Notomi等[19]研發(fā)出一種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其針對靶標(biāo)序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，在恒溫(60～ 65 ℃)條件下，利用Bst DNA 聚合酶的鏈置換作用，按照目標(biāo)序列將dNTPs連接完成DNA擴(kuò)增，同時(shí)釋放出焦磷酸根離子。焦磷酸根離子與Mg2+結(jié)合生成肉眼可視的白色焦磷酸鎂沉淀，使LAMP結(jié)果不必借助其他方式即可快速讀取。因此，恒定的擴(kuò)增條件，可視的結(jié)果顯示使LAMP技術(shù)非常適合現(xiàn)場的快速檢測。

玉米內(nèi)州萎蔫病菌rRNA 16S-23S基因間隔序列已被證實(shí)具備菌種間差異性，常用于分子生物學(xué)鑒定[20-21]。筆者利用LAMP技術(shù)，針對rRNA 16S-23S基因間隔序列設(shè)計(jì)一套引物，建立玉米內(nèi)州萎蔫病菌的快速恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌株供試菌株玉米內(nèi)州萎蔫病菌(Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis，Cmn)、玉米細(xì)菌性枯萎病菌(Pantoeastewartiisubsp.Stewartii，Pss)由浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院張明哲博士提供；燕麥?zhǔn)乘峋?Acidovoraxavenaesubsp.Avenae，Aaa)、西瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrull，Aac)、黃單胞菌(Xanthomonasoryzae，oryzae，Xoo)由浙江大學(xué)李斌博士提供；菜豆萎蔫病菌(Curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens，Cff)、丁香假單胞桿菌菜豆致病變種(Pseudomonassyringaepv.phaseolicola，Psp)由舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局國家糧油重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和儀器 LAMP法脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒(榮研)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)，DL 2000 DNA Ladder Marker (TaKaRa)，瓊脂糖Agarose H(上海生工)，LB瓊脂(杭州微生物試劑有限公司)；金屬浴Thermomixer comfort(eppendorf),凝膠成像儀(BIO-RAD),紫外分光光度計(jì)NANODROP 2000(Thermo)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成玉米內(nèi)州萎蔫病菌16S-23S基因間隔序列已被證實(shí)在細(xì)菌種間有相當(dāng)大的可變性,常用來比較細(xì)菌的親緣性遠(yuǎn)近[22]。根據(jù) GenBank 公布的玉米內(nèi)州萎蔫病菌Cmn 16S-23s序列(Accession number: JN613835.1)，利用LAMP在線引物設(shè)計(jì)軟件(V3版)，設(shè)計(jì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌LAMP引物。引物序列：F3：CGCTCATGGGTGGAACAT，B3：GTTCTCAATATACGGGCGGT；FIP：CATGCCCTCGACACACCAGACTGATGTGTCGGGCTGCTA，BIP：CGCTGTTGGGT-CCTGAGGGAACGAAAGGACGACGGAAAG；LF：ACCCCACA-AGGAGGCGTA，LB：GCACCTTCGGGTGTGTCTG。引物位置見圖1。

1.4菌體培養(yǎng)和DNA模板制備菌體的活化培養(yǎng)用普通LB固體培養(yǎng)基，涂板后放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后挑取單菌落接入普通LB培養(yǎng)液，25 ℃培養(yǎng)12 h(OD600≈0.8)。離心收集菌體，利用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，紫外分光光度計(jì)Nanodrop 2000檢測提取質(zhì)量和濃度，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 LAMP 擴(kuò)增體系優(yōu)化以脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒(LAMP法)說明書推薦體系為參照。設(shè)置反應(yīng)溫度梯度為61、62、63、64、65 ℃；設(shè)置內(nèi)引物、環(huán)化引物和外引物比例分別為2∶2∶1(10 pmol∶10 pmol∶5 pmol)，4∶4∶1(20 pmol∶20 pmol∶5 pmol)，6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)，8∶4∶1(40 pmol∶20 pmol∶5 pmol)；設(shè)置反應(yīng)時(shí)間梯度為15、30、45、60 min。擴(kuò)增產(chǎn)物加SYBR Green I染料以陰性對照進(jìn)行目測或于2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6特異性驗(yàn)證取玉米內(nèi)州萎蔫病菌和各參比菌株基因組，分別取2 μl為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)和常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng)[18]，驗(yàn)證LAMP擴(kuò)增反應(yīng)特異性。

1.7 靈敏性檢測 取玉米內(nèi)州萎蔫病菌基因組，用滅菌的雙蒸水10倍梯度稀釋(10-1～10-7)，取2 μl 為模板分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)并與普通PCR反應(yīng)體系[18]比較，驗(yàn)證LAMP擴(kuò)增法檢測體系對細(xì)菌基因組的靈敏性；制備玉米內(nèi)州萎蔫病菌懸液，進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-6)，涂板計(jì)數(shù)法測定其濃度，分別取2 ul稀釋菌液進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測LAMP等溫?cái)U(kuò)增對菌體檢測的靈敏度。

2結(jié)果與分析

2.1 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化

2.1.1內(nèi)引物、環(huán)化引物和外引物濃度優(yōu)化。由圖2A、a可知，在引物比為2∶2∶1、4∶4∶1、6∶4∶1、8∶4∶1時(shí)均能產(chǎn)生清晰的梯度性條帶，從凝膠成像的條帶亮度上可以看出，引物比為6∶4∶1與8∶4∶1時(shí)的條帶相比引物比例2∶2∶1和4∶4∶1時(shí)產(chǎn)生的條帶更加明亮；引物比為6∶4∶1與引物比為8∶4∶1時(shí)凝膠成像的條帶亮度相當(dāng)。根據(jù)使用較少的內(nèi)引物產(chǎn)生相似的擴(kuò)增效果，選擇內(nèi)引物、環(huán)化引物和外引物的比6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)為LAMP擴(kuò)增反應(yīng)最佳引物比例。

2.1.2 擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化。研究表明，環(huán)化引物的加入與未加入相比其LAMP反應(yīng)時(shí)間縮短50%以上[23]，設(shè)定擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間梯度為15、30、45、60 min，以篩選玉米內(nèi)州萎蔫病菌LAMP檢測方法的最佳反應(yīng)時(shí)間。由圖2B、b可知，LAMP在擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行15 min即開始產(chǎn)生梯度性條帶，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到30 min即可產(chǎn)生清晰的梯度性條帶，因此選擇30 min作為 LAMP 擴(kuò)增體系的最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.1.3 擴(kuò)增反應(yīng)溫度的優(yōu)化。由圖2C、c可知，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)在62、63、64 ℃可以產(chǎn)生清晰的梯度性條帶，其中64 ℃時(shí)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶更明亮；在61 ℃和65 ℃產(chǎn)生的條帶模糊不清。因此選擇64 ℃作為LAMP擴(kuò)增體系的反應(yīng)溫度。

2.2 特異性驗(yàn)證結(jié)果 利用TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒提取玉米內(nèi)州萎蔫病菌、參比菌株的 DNA， 紫外分光光度計(jì)Nanodrop 2000 驗(yàn)證提取效果，取2 μl為模板分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，驗(yàn)證LAMP優(yōu)化體系的特異性。由圖3可知，只有以玉米內(nèi)州萎蔫病菌為模板進(jìn)行LAMP能產(chǎn)出清晰的梯度性條帶，其他以參比菌株DNA為模板的LAMP擴(kuò)增均沒有出現(xiàn)梯度性條帶。結(jié)果表明，該試驗(yàn)建立的針對玉米內(nèi)州萎蔫病菌的LAMP檢測方法特異性強(qiáng)。

2.3 靈敏度檢測結(jié)果

2.3.1基因組DNA靈敏度。提取玉米細(xì)菌性枯萎病菌基因組DNA，通過NanodropTM超微量分光光度計(jì)測量DNA吸光值，計(jì)算DNA濃度為50 ng/μl，調(diào)整濃度至25 ng/μl， 10倍梯度稀釋，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和普通PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證LAMP優(yōu)化體系針對基因組的靈敏度。由圖4A、a可知，LAMP檢測體系檢測靈敏度可達(dá)2.5×10-5ng/μl，即每反應(yīng)體系需50 fg(2 μl，2.5×10-5ng/μl)模板，比普通PCR(圖 4B)檢測靈敏度(5 pg)高100倍。

2.3.2 菌體檢測靈敏度。取100 ul玉米內(nèi)州萎蔫病菌菌懸液原液，用雙蒸水進(jìn)行10倍梯度稀釋，涂板測定玉米內(nèi)州萎蔫病菌菌懸液濃度為1.8×109CFU/ml,分別取2 μl稀釋液為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)，驗(yàn)證LAMP優(yōu)化體系針對菌體的靈敏性。由圖4D、d可知，LAMP檢測體系檢測靈敏度能夠達(dá)到3.6 CFU(2 μl,1.8×103CFU/ml)，而普通 PCR的檢測靈敏度為3.6×102CFU(2 μl,3.6×105CFU/ml)(圖4E)。對比LAMP體系和普通PCR體系凝膠成像結(jié)果表明，LAMP 檢測體系的靈敏度比普通 PCR 的靈敏度高100倍。

3結(jié)論與討論

我國玉米產(chǎn)量和種植面積均居世界第二位，玉米在我國糧食生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。從2010年起，我國出現(xiàn)玉米凈進(jìn)口態(tài)勢，2012～2014年，3年玉米進(jìn)口總量超過1 000萬t。玉米內(nèi)州萎蔫病菌隨進(jìn)口玉米傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)很高。目前針對玉米內(nèi)州萎蔫病菌的檢疫方法主要有分離培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫法、常規(guī)PCR、TagMan-PCR、巢氏PCR、REP-PCR 基因指紋技術(shù)以及2種或2種以上方法的結(jié)合，以上方法或操作復(fù)雜、耗時(shí)較長或需要PCR等儀器的支持，無法實(shí)現(xiàn)基層檢疫人員現(xiàn)場、快速檢疫的要求，不利于推廣。該試驗(yàn)采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)，可以有效克服以上方法的不足，其反應(yīng)過程僅需要金屬浴小型裝備的支持，且結(jié)果不需要通過電泳儀等設(shè)備可以直接目視或者加入熒光染料紫外照射觀察，這有效克服了試驗(yàn)場地的限制。該研究結(jié)果表明，LAMP反應(yīng)菌體檢測靈敏度高達(dá)3.6 CFU，現(xiàn)場檢測可以直接淋取菌液進(jìn)行試驗(yàn)，有效彌補(bǔ)其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)菌體靈敏度不高，需提取基因組DNA進(jìn)行檢測，減少了操作的復(fù)雜性；同時(shí)LAMP檢測反應(yīng)時(shí)間縮短到30 min，大大提高了檢測的效率。

該試驗(yàn)每個(gè)過程均重復(fù)3次，結(jié)果顯示該方法具有可靠的穩(wěn)定性和較高的重復(fù)性。研究表明LAMP檢測玉米細(xì)菌性枯萎病菌體檢測靈敏度在1 CFU以下[24]，該試驗(yàn)針對玉米內(nèi)州萎蔫病菌的檢測靈敏度能否進(jìn)一步提高還有待進(jìn)一步研究。另外，雖然該試驗(yàn)證實(shí)LAMP法反應(yīng)具有很高的特異性，但針對玉米內(nèi)州萎蔫病菌親緣關(guān)系相近的不同亞種，如Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus、Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis的特異性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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