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    工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的提取條件優(yōu)化

    2015-12-25 02:00:58萬玉軍唐曉芳李鎮(zhèn)江王剛楊曉琴鄭君黃偉江源鋼王宏
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2015年6期
    關(guān)鍵詞:普魯蘭寡糖脫色

    萬玉軍,唐曉芳,李鎮(zhèn)江,王剛,,楊曉琴,鄭君,黃偉,江源鋼,王宏

    1(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院,四川成都,611130)

    2(成都金開生物工程有限公司,四川成都,611130)

    普魯蘭多糖是一種特殊的微生物胞外多糖,是由出芽短桿霉發(fā)酵產(chǎn)生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性黏質(zhì)多糖[1-3]。因其水溶性好、溶液黏稠穩(wěn)定、優(yōu)良的增稠作用[4-5]、無色無味無毒性、安全性好等特點(diǎn)[6],已被廣泛用于醫(yī)藥、食品、輕工、化工和石油[7-9]等領(lǐng)域,另外在煙草工業(yè)、農(nóng)業(yè)種子保護(hù)等領(lǐng)域[10-11]也逐步被應(yīng)用,是一種很有前景的工業(yè)用多糖。但目前尚未實(shí)現(xiàn)規(guī)?;a(chǎn),原因在于普魯蘭多糖菌種產(chǎn)率低、發(fā)酵提取工藝有較大的局限性,比如如何除雜(菌體以及無機(jī)鹽、有機(jī)殘余物)、脫色(發(fā)酵液中色素沉積過多)、去蛋白(保留目的產(chǎn)物,去除雜蛋白)等問題[12-14]。篩選出了1株產(chǎn)率可達(dá)68~71 g/L的普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株,已經(jīng)用于5 t發(fā)酵罐規(guī)模的生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過對普魯蘭多糖5 t發(fā)酵罐規(guī)模發(fā)酵后,對普魯蘭多糖提取過程中所遇到的難點(diǎn)進(jìn)行研究,旨在解決提取問題,為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    菌株:出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)A-22菌株,來源于成都金開生物公司實(shí)驗(yàn)室。

    普魯蘭發(fā)酵液。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

    NaOH、HCl、乙醇、H2SO4等均為分析純試劑,成都市科龍?jiān)噭┗S生產(chǎn)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

    壓濾機(jī)、超濾膜設(shè)備、NDJ-8S數(shù)字式黏度計(jì),上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;高速臺式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;UV1800PC型紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)有限公司。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 提取工藝流程

    發(fā)酵液預(yù)處理→除菌體雜質(zhì)→活性炭脫色→樹脂(脫色、去蛋白)→超濾→干燥

    1.4.2 發(fā)酵液預(yù)處理

    發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液經(jīng)過80℃高溫滅酶,稀釋到2%,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.4.3 硅藻土的選型、用量

    選取兩種硅藻土進(jìn)行過濾,預(yù)處理過后的發(fā)酵液分成等體積的3份,硅藻土的量選擇1%、2%、3%,制成厚度不同的濾餅層,進(jìn)行板框過濾,過濾后,測定發(fā)酵液的澄清度(透過率)和含糖量。

    1.4.4 活性炭對普魯蘭多糖脫色效果實(shí)驗(yàn)

    1.4.4.1 活性炭的用量

    取等體積的經(jīng)除菌后的發(fā)酵液6份,在自然pH,溫度40℃,脫色時間30 min,攪拌條件下,活性炭的用量分別為 0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%(活性炭用量/發(fā)酵液體積),經(jīng)過濾后,在吸光度420 nm條件下測定吸光值,得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

    1.4.4.2 活性炭脫色時間

    取等體積的經(jīng)除菌后的發(fā)酵液6份,在活性炭用量為0.5%,自然pH,溫度40℃,攪拌條件下,篩選脫色時間為20、30、40、50、60、70 min 時脫色效果,經(jīng)過濾后,在吸光度420 nm條件下測定吸光值,得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

    1.4.4.3 活性炭脫色溫度

    取等體積的經(jīng)除菌后的發(fā)酵液6份,在活性炭用量為0.5%,自然pH,脫色時間為40 min,攪拌條件下,篩選溫度為 30、40、50、60、70、80 ℃時脫色效果,經(jīng)過濾后,在吸光度420 nm條件下測定吸光值,得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

    1.4.4.4 活性炭脫色pH

    取等體積的經(jīng)除菌后的發(fā)酵液6份,在活性炭添加量為0.5%,溫度50℃,脫色時間為40 min,攪拌條件下,篩選 pH 為4.5、5、5.5、6、6.5、7 時脫色效果,經(jīng)過濾后,在吸光度420 nm條件下測定吸光值,得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

    1.5 吸附樹脂選型

    活性炭對發(fā)酵液脫色后,用樹脂進(jìn)行進(jìn)一步脫色、去蛋白。在實(shí)驗(yàn)過程中,選用了5種樹脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別裝相同柱高,選用活性炭脫色完的發(fā)酵液,每份體積相同,過柱,過完之后,觀察顏色,得出多糖的得率、損失率及測定含氮量,選擇作用明顯的樹脂。

    1.6 超濾

    過完樹脂后的發(fā)酵液,濃度為1.5%,進(jìn)行超濾,體積濃縮為4%,再次加入等體積的純水,超濾。同樣的操作進(jìn)行5次,超濾完后,計(jì)算發(fā)酵液中的單二寡糖的含量及多糖損失率。

    1.7 干燥方式的選擇

    取等體積超濾完的發(fā)酵液4份(配制成5%的濃度),分別采用冷凍干燥、噴霧干燥、滾筒干燥、微波真空干燥4種干燥方式,對其進(jìn)行干燥。分析干燥成本,干燥完之后看產(chǎn)品的復(fù)溶性(取3 g溶于100 mL水,置于攪拌器上,800 r/min攪拌至完全溶解)。

    1.8 分析方法

    1.8.1 發(fā)酵液多糖的測定

    普魯蘭多糖含量的測定:樣品中普魯蘭多糖的定量分析采用高效液相色譜進(jìn)行測定。流動相A:水;流動相 B:乙腈,其比例7∶3。取一定體積的樣品,經(jīng)過離心,取一定體積的上清液(普魯蘭多糖含量在0.200~0.300 g),加100 μL普魯蘭酶,定容至50 mL。在58℃下酶解4 h,經(jīng)0.45 μm膜過濾備用。進(jìn)樣量為10 μL,流速為1.0 mL/min。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求普魯蘭多糖的含量。

    1.8.2 發(fā)酵液的黏度測定

    采用NDJ-8S數(shù)字式黏度計(jì)測定。

    1.8.3 色素的測定

    樣品中色素測定通過UV1800PC型紫外可見分光光度計(jì)在420nm處的吸光值表示。

    1.8.4 樣品中含氮量測定

    凱氏定氮法[16]。

    1.8.5 單二寡糖測定[7]

    硫酸蒽酮法。單二寡糖去除率:(超濾前單二寡糖含量-超濾后單二寡糖含量)/超濾前單二寡糖含量 ×100)。

    1.8.6 普魯蘭多糖的灰分測定[17]

    灼燒殘?jiān)ā?/p>

    1.8.7 普魯蘭多糖的含水量測定[18]

    直接干燥法。

    1.8.8 普魯蘭多糖的黏度測定[7]

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

    2.1 硅藻土的選型、用量

    硅藻土的用量如表1所示,壓濾后的發(fā)酵液的澄清度(透過率)和多糖得率,確定硅藻土的型號及用量。

    表1 助濾劑添加量對助濾效果的影響Table 1 The effect of diatomaceous earth dosage on filter

    從表1可以看出,因?yàn)槠蒸斕m多糖性質(zhì)特殊,所以濾餅層硅藻土型號和用量的不同直接影響發(fā)酵液的澄清度和目的產(chǎn)物的得率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以1號硅藻土作為助濾劑,用量2%,此時普魯蘭多糖的得率高、澄清度較好。

    2.2 活性炭用量、脫色時間、脫色溫度、脫色最適pH

    2.2.1 活性炭的用量

    活性炭是多孔性固體吸附劑,吸附能力較強(qiáng)。如圖1所示,隨著活性炭的用量不斷加大,脫色率逐漸增大,脫色效果較好,用量超過0.5%,脫色效果不穩(wěn)定?;钚蕴苛康募哟?,多糖的損失率不斷增大,可能是活性炭吸附多糖,造成一定損失。選擇用量為0.5%,既能達(dá)到良好的脫色效果,節(jié)約活性炭用量,同時還可以降低多糖的損失。

    圖1 不同用量的活性炭對脫色的影響Fig.1 The influence of different dosage of active carbon decoloring effect

    2.2.2 活性炭脫色時間

    如圖2所示,隨著時間的延長,40 min時是脫色效果最好,此時可能已達(dá)到活性炭吸附色素的飽和度,60 min以后脫色效果有所下降,可能是時間太長,導(dǎo)致發(fā)酵液中小分子糖發(fā)生褐變反應(yīng),反而有色素產(chǎn)生,影響脫色效果。因此選擇最適脫色時間為40 min。

    圖2 脫色時間對活性炭脫色效果的影響Fig.2 Different time on the decoloring effect of activated carbon

    2.2.3 活性炭脫色溫度

    如圖3所示,溫度對活性炭脫色影響較明顯,在溫度較低時,脫色效果不好,活性炭的吸附能力較差,到達(dá)吸附飽和的時間長。而在溫度高時,脫色效果變差,可能是因?yàn)榘l(fā)酵液僅經(jīng)過除菌預(yù)處理,液體中含有較多小分子糖類,蛋白質(zhì)等其它雜質(zhì),高溫下易發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生新的色素。同時,溫度過高,活性炭對多糖的吸附能力也增加,損失率增大。因此選擇脫色溫度為50℃,多糖的脫色效果好,損失率低。

    圖3 不同的溫度對活性炭脫色效果的影響Fig.3 Different temperature on the decoloring effect of activated carbon

    2.2.4 活性炭脫色pH

    如圖4所示,脫色液pH5.5時,活性炭脫色效果最高,pH>6,脫色率降低,pH在5~7之間多糖的損失率較低。因此,提高脫色效果和降低多糖損失率的前提下,選擇在pH為5.5作為最適活性炭脫色pH值。

    圖4 不同pH對活性炭脫色效果的影響Fig.4 Different pH on the decoloring effect of a activated carbon

    2.3 吸附樹脂選型

    從圖5中可以看出,編號分別為A-E的5種樹脂,對發(fā)酵液進(jìn)一步脫色、去蛋白,樹脂A型相對于其他4種,脫色率最高,能達(dá)到96%,C、D、E三種樹脂脫色效果接近,脫色率94%左右,B型脫色率最低。脫完色后計(jì)算多糖的損失率,D型的損失率最低,C型損失率最高。對于去蛋白,A、B兩種氮含量較高,C、D、E三種氮含量差距不大。依據(jù)能達(dá)到良好脫色效果,并且對于多糖的損失降到最低,達(dá)到一定去蛋白的效果,通過篩選,D型樹脂能達(dá)到較佳的效果。

    2.4 超濾

    試驗(yàn)中提取的多糖分子質(zhì)量在20萬左右,但是經(jīng)過脫色后的發(fā)酵液中,含有大量的單二寡糖等小分子糖類,因此采用超濾手段去除小分子糖類,截留目的產(chǎn)物,提高產(chǎn)品純度,同時也可以起到濃縮的作用。圖6可以看出,超濾第1次,單二寡糖的去除率達(dá)到84.8%,繼續(xù)超濾,單二寡糖的去除率相比較第1次都很低了,此時去除作用已經(jīng)不明顯了,但是隨著超濾次數(shù)的增大,多糖的損失率逐漸增加。超濾3次,能使單二寡糖的去除率達(dá)到96.6%,符合標(biāo)準(zhǔn),同時降低多糖的損失、節(jié)約成本。

    圖5 不同類型的樹脂對多糖脫色及蛋白去除的影響Fig.5 Different types of resin decolorization of polysaccharide and protein removal

    圖6 超濾次數(shù)對去除單二寡糖效果的影響Fig.6 Number of times of ultrafiltration to remove(Mono-di-and oligosaccharides)effect

    2.5 干燥方式的選擇

    實(shí)驗(yàn)所采用的4種干燥方式特點(diǎn)如下:冷凍干燥,要求很高的真空和低溫,對設(shè)備要求高,干燥時間過長,這些因素?zé)o形中增加了生產(chǎn)成本,冷凍干燥后的多糖,復(fù)溶性好、溶液透亮;滾筒干燥,干燥時間短、可以連續(xù)操作、熱效率高,但是干燥完之后得用刮刀將其刮下,干燥后的產(chǎn)品較硬,復(fù)溶性較好;噴霧干燥,雖然其生產(chǎn)過程簡化,操作控制方便,但是其所需設(shè)備體積較龐大、投資大,同時熱效率很低、能耗大,干燥后的產(chǎn)品復(fù)溶性極差;微波干燥,干燥時,能量效率不高,加熱不均勻,局部溫度過高,導(dǎo)致產(chǎn)品顏色不正,表面硬化,復(fù)溶性較差。綜合設(shè)備、能耗成本考量,對比4種干燥方式,我們選用滾筒干燥方式,其干燥時間短、熱效率高,較其他3種干燥方式干燥效果好、成本低,產(chǎn)品復(fù)溶性好。

    表2 不同干燥方式對復(fù)溶性的影響Table 2 The effect of different drying methods on the complex solubility

    2.6 提取后成品質(zhì)量參數(shù)

    產(chǎn)品:白色粉末狀、純度 93.31%、黏度 160 mm2/s、水分 3.85%、灰分 1.34%、總氮含量0.045%、單二寡糖1.5%、pH 5.7,提取的成品質(zhì)量符合國標(biāo)要求。

    3 討論

    隨著普魯蘭多糖的使用范圍不斷擴(kuò)大,提取成本較高、難度較大等現(xiàn)狀,本實(shí)驗(yàn)對發(fā)酵液中普魯蘭多糖的提取條件進(jìn)行了研究,包括除雜時所需硅藻土的型號、用量,脫色過程中活性炭的用量及最適脫色條件,均采用單因素實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,選取一號硅藻土作為助濾劑,用量2%,濾液澄清度高、過濾速度快;脫色活性炭的添加量為0.5%、溫度50℃、時間40 min、pH 5.5,脫色效果好、普魯蘭多糖得率高;樹脂型號D,使得二次脫色效果良好,同時能去除一些雜蛋白;超濾兩次,單二寡糖的去除率能達(dá)到96.6%在此條件下,發(fā)酵液除雜效果理想、澄清度較高、脫色效果好且普魯蘭多糖得率較高、損失率低;我們選用滾筒干燥方式,其干燥時間短、熱效率高,干燥成本低,干燥后的成品效果好,能達(dá)到質(zhì)量要求。

    由于日本對普魯蘭多糖后提取工藝技術(shù)的封鎖,對其后提取工藝報道很少,基本上都在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。本實(shí)驗(yàn)是在5 t發(fā)酵罐規(guī)模發(fā)酵后,對發(fā)酵液中普魯蘭多糖的提取工藝進(jìn)行研究。在提取過程中,本實(shí)驗(yàn)篩選出一種高性能樹脂,對發(fā)酵液進(jìn)行二次脫色,同時還可以使一些膠體,雜蛋白等雜質(zhì)與普魯蘭多糖分離,有別于目前普魯蘭多糖的提取工藝,具有一定的創(chuàng)新性。采用膜分離技術(shù),既能夠去除大量的單二寡糖以及一些小分子糖類,也能夠達(dá)到一定的濃縮目的,保證了產(chǎn)品的純度及質(zhì)量。選用區(qū)別于傳統(tǒng)噴霧干燥方式的滾筒干燥方法,降低了干燥成本,產(chǎn)品干燥效果好且復(fù)溶性更好。普魯蘭多糖的提取方法多采用醇沉法,存在乙醇用量大且重復(fù)利用成本高、生產(chǎn)安全性降低、產(chǎn)品帶有乙醇的味道等缺點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)所研究的提取方法不使用乙醇,既降低提取成本,也使得提取過程更加安全。以上一些提取工藝的改進(jìn),為以后工業(yè)化生產(chǎn)(50 t發(fā)酵罐規(guī)模)提供數(shù)據(jù)參考,奠定了一定的基礎(chǔ)。

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