水胺硫磷半抗原分子的設(shè)計(jì)及其免疫效果*

劉波，袁利鵬，林丹瓊，熊波，高秀杰

1(廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱作系，廣東 廣州，510507)2(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東順德，528300)

3(中山大學(xué) 達(dá)安基因股份有限公司，廣東廣州，510665)

水胺硫磷(isocarbophos，ICP)，手性有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides，OPs)的一種，由于具有殺蟲(chóng)效率高，堿性條件下易分解等優(yōu)點(diǎn)，一度成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要?dú)⑾x(chóng)劑之一。但I(xiàn)CP的濫用，不僅會(huì)造成農(nóng)藥在環(huán)境中的殘留，還可通過(guò)食物鏈的富集作用使動(dòng)物和人中毒，進(jìn)而對(duì)人體的代謝平衡產(chǎn)生影響，尤其是對(duì)兒童神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育產(chǎn)生更為嚴(yán)重的影響［1-2］。2010年海南發(fā)生的“毒豇豆”事件，其元兇就是ICP。

目前，水胺硫磷的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)［3］、氣相色譜法(GC)［4-5］、液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS/MS)［6-7］等。這些方法雖然具有很好的準(zhǔn)確度和靈敏度，但需要昂貴的檢測(cè)設(shè)備，且樣品的前處理操作較繁瑣，單個(gè)樣品的檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，不能快速提供檢測(cè)結(jié)果。因此建立一種新的快速、靈敏、檢測(cè)成本低的檢測(cè)ICP方法，尤其是痕量ICP的檢測(cè)方法，是目前分析化學(xué)需要研究的重要課題。近年來(lái)，免疫分析技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留分析和摻偽食品鑒定領(lǐng)域，以其簡(jiǎn)單、廉價(jià)、快捷、靈敏度高、適用于大批量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而成為一種重要的分析方法。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)ICP的免疫化學(xué)檢驗(yàn)方法及產(chǎn)品的報(bào)道，本研究設(shè)計(jì)合成了ICP半抗原，并制備了抗ICP多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 主要試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，美國(guó)Sigma公司;水胺硫磷及其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH;羊抗兔IgG-HRP，購(gòu)于博士德公司;三氯硫磷，西亞試劑公司;二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和其他化學(xué)試劑，阿拉丁試劑公司;包被緩沖液(0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)、封閉液(含1% 明膠的0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)、洗滌液 PBST(含0.05%Tween-20的0.01 mol/L，pH 7.4的PBS)、底物緩沖液(pH 5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液)、底物TMB(2 mg/L DMSO)、終止液(2 mol/L H2SO4)，均為實(shí)驗(yàn)室配制。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔2只，雌性，體重3 kg以上，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 主要儀器

HP1100液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)，Agilent;多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)，Perkin Elimer;Wellwash MK2洗板機(jī)，美國(guó)Thermo;UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津分析儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 半抗原的合成及結(jié)構(gòu)鑒定

合成方法如圖1所示。稱取10.4 g水楊酸放入圓底燒瓶，然后依次加入4.5 L濃H2SO4和20 mL無(wú)水異丙醇，油浴加熱至100℃冷凝回流12 h后冷卻至室溫加水稀釋，用乙酸乙酯萃取3次，每次用乙酸乙酯20 mL，合并有機(jī)層用飽和NaHCO3洗滌2遍，最后再用飽和食鹽水洗1遍，有機(jī)層用無(wú)水Na2SO4除水干燥后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干有機(jī)溶劑得到淺黃色水楊酸異丙酯。

圖1 水胺硫磷半抗原H-ICP的合成路線Fig.1 The synthesis scheme of H-ICP hapten

用量筒量取15 mL三氯硫磷于圓底燒瓶中，在-5～0℃強(qiáng)烈攪拌下緩慢加入30 mL無(wú)水甲醇反應(yīng)2 h，產(chǎn)物用冰水振搖2～3次除去甲醇和產(chǎn)生的HCl，有機(jī)層用無(wú)水Na2SO4除水干燥后得到無(wú)色透明液體O-甲基硫代磷酰二氯，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取水楊酸異丙酯2 g加入10 mL二氯甲烷和60 mg四丁基溴化銨冷卻至0℃左右，攪拌下逐滴加入4 g O-甲基硫代磷酰二氯，加熱升至室溫，再滴加20%的NaOH溶液，反應(yīng)過(guò)程用pH試紙監(jiān)控使溶液pH值保持在11左右，反應(yīng)4 h后分離出二氯甲烷相蒸干，過(guò)柱純化得到產(chǎn)物O-甲基-O-2-水楊酸異丙酯硫代磷酰一氯。

稱取O-甲基-O-2-水楊酸異丙酯硫代磷酰一氯500 mg，加入5 mL二氧六環(huán)，置于0℃下攪拌，攪拌下逐滴加入2 mL溶有170 mg NaOH和210 mg 6-氨基己酸，隨后加熱升溫至室溫;反應(yīng)4 h后點(diǎn)板監(jiān)控，待反應(yīng)完全后用稀鹽酸將溶液的pH值調(diào)至酸性，用三氯甲烷萃取蒸干得到淺黃色油狀物，過(guò)柱純化得到終產(chǎn)物H-ICP。

由圖2可見(jiàn)，在APCI-MS正離子譜圖中存在m/z為403.9的質(zhì)譜峰，該產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量與目標(biāo)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量403.1一致，結(jié)合反應(yīng)路線，可以推斷合成產(chǎn)物即為所需的目標(biāo)半抗原，說(shuō)明該合成路線可以用于水胺硫磷半抗原的合成。同時(shí)可見(jiàn)，403.9的分子離子峰是最強(qiáng)峰，表明新產(chǎn)物為反應(yīng)體系中的主要物質(zhì)，說(shuō)明反應(yīng)產(chǎn)物具備相對(duì)較高的純度。

圖2 水胺硫磷半抗原H-ICP的質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrum of H-ICP hapten

1.2.2 人工抗原制備與鑒定

采用活潑酯法制備免疫原H-ICP-BSA、包被原H-ICP-OVA，抗原鑒定采用文獻(xiàn)［8］的方法進(jìn)行。在波長(zhǎng)200～400 nm區(qū)間，對(duì)各人工抗原的紫外吸收光譜進(jìn)行測(cè)定，鑒定半抗原與載體蛋白(BSA或OVA)是否偶聯(lián)成功［9］。

人工抗原的紫外掃描結(jié)果表明，與相應(yīng)載體蛋白BSA或OVA比較，偶聯(lián)產(chǎn)物的最大紫外吸收峰在波長(zhǎng)215～225 nm或270～280 nm范圍發(fā)生了明顯變化，其中由半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)所得到的人工抗原在225～250 nm內(nèi)出現(xiàn)了強(qiáng)吸收峰，與相應(yīng)蛋白的吸收峰比較，發(fā)生了紅移，可能是由于這些半抗原具有共軛結(jié)構(gòu)，在250 nm左右有強(qiáng)吸收峰或吸收帶所引起的。

圖3 H-ICP人工抗原紫外掃描譜圖Fig.3 UV spectrum of H-ICP artificial antigens and hapten

1.2.3 多克隆抗體的制備

選取2只新西蘭雌性大白兔用免疫原H-ICPBSA進(jìn)行免疫，免疫劑量為500 μg/只。首次免疫，取抗原與弗氏完全佐劑乳化，采用背部多點(diǎn)免疫健康大白兔。間隔3周，取抗原與弗氏不完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫。以后免疫每隔2周進(jìn)行免疫。取耳緣靜脈血，采用ELISA方法測(cè)定抗血清效價(jià)。待效價(jià)穩(wěn)定后，再加強(qiáng)免疫一次。最后一次免疫后10 d心臟采血，室溫靜置1 h，再置4℃冰箱12 h，4 000 r/min離心10 min，收集血清，-20℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)分析，手臂位點(diǎn)和ICP特征結(jié)構(gòu)將成為ICP半抗原設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)，這也是研究ICP農(nóng)藥免疫速測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)?？紤]到ICP主要有2部分特征結(jié)構(gòu)組成，即甲氧基硫代磷酸酯部分和苯環(huán)部分，其中從硫代磷酸酯部分衍生出的手臂不但可以最大化的保留其特征結(jié)構(gòu)，而且在與載體蛋白偶聯(lián)后使苯環(huán)部分也充分的暴露出來(lái)可以增強(qiáng)免疫原性(見(jiàn)圖1)。

2.2 抗體靈敏度的測(cè)定

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA工作程序測(cè)定抗血清對(duì)ICP的競(jìng)爭(zhēng)曲線，參照劉鳳權(quán)等人［10］的方法，并采用Originlab 7.5的四參數(shù)擬合模塊對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)曲線進(jìn)行 S擬合，計(jì)算曲線IC50值，以H-ICPOVA為包被原，建立間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖4)。該方法的IC50為5.3 ng/mL，檢定量線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為1.77～10.06 ng/mL。

圖4 水胺硫磷的間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The icELISA standard curve of ICP

2.3 抗體的特異性研究

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA程序在同等條件下依次建立水胺硫磷及其類似物的標(biāo)準(zhǔn)品ELISA曲線，求出各自抑制率為50%時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，用IC50表示，然后再換算成摩爾濃度后用公式計(jì)算出每種結(jié)構(gòu)類似物與抗體的交叉反應(yīng)率，則:交叉反應(yīng)率/%=(水胺硫磷IC50/類似物IC50)×100

由表1可以看出所制備的抗體特異性非常好，獲得的抗血清和其他結(jié)構(gòu)類似物均無(wú)交叉反應(yīng)，可用于果蔬中水胺硫磷的快速檢測(cè)。

表1 水胺硫磷與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率結(jié)果(n=3)Table 1 Cross reactivity of ponoclonal antibody with analogous compound of ICP(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)合成水胺硫磷半抗原、制備人工抗原合成、動(dòng)物免疫，首次獲得針?biāo)妨蛄椎亩嗫寺】贵w，且該抗體對(duì)結(jié)構(gòu)類似物均無(wú)明顯的交叉反應(yīng)，說(shuō)明半抗原的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合理，并為其單克隆抗體的研制、酶免分析方法的建立以及環(huán)境、食品中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)提供了具有一定價(jià)值的研究基礎(chǔ)和技術(shù)。

［1］ Pehkonen S O，ZHANG Q.Critical Revi Environm［J］.Science and Technology，2002，32(1):17

［2］ 顏曉娜，許金生，王麗麗，等.水胺硫磷分子印跡傳感器的制備與應(yīng)用［J］.分析試驗(yàn)室，2012，32(2):41-46

［3］ 葉江雷，弓振斌，林芳，等.茶葉中水胺硫磷、亞胺硫磷、甲基對(duì)硫磷和伏殺硫磷農(nóng)藥殘留的高效液相色譜法測(cè)定［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，46(3):441-444.

［4］ 樓國(guó)柱，徐倩，白曉榮，等.不同提取劑對(duì)茶葉中多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)影響的研究［J］.食品科學(xué)，2004，25(12):165-168.

［5］ 楊小鋼，鄺培翠.氣相色譜法測(cè)定蔬菜和小麥中乙基異柳磷和水胺硫磷兩種農(nóng)藥殘留量［J］.湖北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，16(1):3-5

［6］ Roger J，Hassan S，Emmanuel S，et al.Application of liquid chromatography with mass spectrometry combined with photodiode array detection and tandem mass spectrometry for monitoring pesticides in surface waters［J］.Journal of Chromatography A，2000，879(1):51-71.

［7］ Otero R R，Grande B C，Gandara J S.Multiresidue method for fourteen fungicides in white grapes by liquid-liquid and solid phase extraction followed by liquid chromatography-diode array detection［J］.Journalof Chromatography A，2003，992(1/2):121-131.

［8］ Cho Y A，Kim Y J，Hammock B D，et al.Development of a microtiter plate ELISA and a dipstick ELISA for the determination of the organophosphorus insecticide fenthion［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(27):7 854-7 860.

［9］ Singh K V，Kaur J，Varshney G C，et al.Synthesis and characterization of hapten-protein conjugates for antibody production against small molecules［J］.Bioconjugate Chemistry，2004，15(1):168-173.

［10］ 劉鳳權(quán)，許志剛，王金生.定量測(cè)定甲胺磷殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的建立和初步應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1998，6(2):140-146.