全自動(dòng)定氮儀測(cè)定鮮牛奶氮含量條件的響應(yīng)面優(yōu)化*

鄭朋朋，楊宏杰，寧露娟，陳玉惠，敖新宇

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明，650224)

鮮牛奶中蛋白質(zhì)及其他含氮物質(zhì)在牛奶中的含量即氮含量，是鮮牛奶品質(zhì)的重要指標(biāo)［1］。目前，牛奶氮含量測(cè)定一般采用國標(biāo)凱氏定氮法。該方法是氮含量測(cè)定的國際通用方法，適用樣品廣泛，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但存在試劑消耗量大、檢測(cè)時(shí)間長、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)［2-4］。本研究在國標(biāo)凱氏定氮法原理的基礎(chǔ)上，利用FOSS-2300全自動(dòng)定氮儀，對(duì)牛奶氮含量的測(cè)定試驗(yàn)中的濃硫酸量、催化劑量、消化溫度、消化時(shí)間、NaOH用量5個(gè)因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選和響應(yīng)面優(yōu)化，確定鮮牛奶氮含量測(cè)定的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

鮮牛奶:昆明雪蘭牛奶責(zé)任有限公司。

1.1.2 試劑

濃 HCl、Na2SO4、溴甲酚綠、甲基紅、H3BO3、NaOH、K2SO4、CuSO4、濃 H2SO4，均為分析純。

1.1.3 儀器

全自動(dòng)定氮儀(FOSS-2300)，瑞典福斯分析儀器有限公司;消化儀(FOSS-2300)，瑞典福斯分析儀器有限公司;電子天平(BS224S)、移液槍(Eppendorf)德國;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:取濃HCl加蒸餾水稀釋到一定體積，使HCl溶液濃度在0.1 mol/L左右，準(zhǔn)確稱取Na2SO4(105℃烘箱中恒重)，溶解后定容，取20 mL Na2SO4溶液，滴2滴甲基橙指示劑，用粗配的鹽酸溶液滴定，記錄HCl溶液消耗的體積，計(jì)算HCl溶液的準(zhǔn)確濃度。

硼酸緩沖液:稱取100 g H3BO3，用10 L蒸餾水溶解。

指示劑:分別稱取0.1 g溴甲酚綠和甲基紅，均用100 mL無水乙醇溶解，超聲10 min，過濾后，取100 mL溴甲酚綠和70 mL甲基紅混合均勻，再與H3BO3緩沖液混合。

40%NaOH配制:稱取8 kg NaOH加蒸餾水使體積為20 L。

1.2.2 最佳取樣量的確定

在常規(guī)操作條件下(催化劑量5 g、濃H2SO4量8 mL、消化溫度420℃、消化時(shí)間 240 min，40%NaOH 用量50 mL)，分別取 1、2、4、6、8 mL 鮮牛奶樣品進(jìn)行消化和測(cè)定，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，得到最佳取樣量。

1.2.3 Plackett Burman試驗(yàn)

對(duì)催化劑量、濃H2SO4量、消化溫度、消化時(shí)間、40%NaOH用量5個(gè)因素進(jìn)行Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)［5-6］。選擇試驗(yàn)次數(shù)N=8，每個(gè)因素選擇高低2個(gè)水平，高水平取低水平的1.25倍，氮含量(mgN/mL)為響應(yīng)值。試驗(yàn)結(jié)果通過Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行主效應(yīng)分析，從而篩選出對(duì)實(shí)驗(yàn)影響最大的3個(gè)因素。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Plackett Burman試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Plackett Burman experimental factors and levels design

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

對(duì)Plackett Burman試驗(yàn)主效應(yīng)分析中的貢獻(xiàn)值最大3個(gè)因素設(shè)計(jì)并進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。根據(jù)各因素效應(yīng)的大小設(shè)定變化的方向及步長。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，采用Desigin-Expert8.0.6軟件中 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理［7-8］，選取催化劑量、消化溫度和消化時(shí)間3個(gè)影響因素，分別用A、B、C表示3個(gè)因素，并以 -1、0、1代表因素的3個(gè)水平，氮含量(mgN/mL)為響應(yīng)值，采用3因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)建立的模型的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)最佳的測(cè)定條件，并在預(yù)測(cè)最佳的測(cè)定條件下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，檢驗(yàn)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的差別及在此條件下測(cè)定值的穩(wěn)定性;比較FOSS法與國標(biāo)法穩(wěn)定性的差異，穩(wěn)定試驗(yàn)采用9個(gè)重復(fù)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7 回收率試驗(yàn)

采用4種已知濃度的有機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液模擬鮮牛奶，在最佳的測(cè)定條件下，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，檢驗(yàn)在最佳的測(cè)定條件下測(cè)定值的可信度，并與國標(biāo)法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳取樣量

由圖1可見，鮮牛奶取樣量從1～8 mL時(shí)氮含量測(cè)定值不斷減小。取樣量增加而其他條件不變的情況下，濃H2SO4和催化劑不能完全將鮮牛奶中的有機(jī)氮消化，從而導(dǎo)致氮含量測(cè)定值偏低，所以在試驗(yàn)組里1 mL取樣量是最佳的，考慮到實(shí)際操作，在此后的試驗(yàn)中取樣量均為1 mL鮮牛奶。

圖1 取樣量與測(cè)定值的關(guān)系Fig.1 Relationship between sample volume and the measured values

2.2 Plackett Burman試驗(yàn)

2.2.1 Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(表3)

表3 Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Plackett Burman experimental design and results

2.2.2 Plackett Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

通過Design-Expert8.0.6軟件對(duì)Plackett Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行主效應(yīng)分析，分析結(jié)果見表4。

表4 各因素的主效應(yīng)分析Table 4 Analysis of the main effects of each factor

由表4可見，催化劑量、消化溫度、消化時(shí)間3個(gè)因素貢獻(xiàn)值最大，是氮含量測(cè)定的主要影響因素。其對(duì)氮含量測(cè)定影響的大小為消化溫度＞催化劑量＞消化時(shí)間，因此選取這3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Steepest ascent experimental design and results

由表5的最陡爬坡試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果可知，最優(yōu)的操作條件在試驗(yàn)3和試驗(yàn)5的試驗(yàn)條件之間，故以試驗(yàn)4的試驗(yàn)條件作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)(即0)，試驗(yàn)3、試驗(yàn)5的條件分別作為-1和1，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

運(yùn)用Desigin-Expert8.0.6軟件中Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以氮含量/(mgN/mL)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為零點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6。

2.4.2 回歸模型建立與方差分析

運(yùn)用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表6中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次多項(xiàng)式回歸模型，并對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表7所示。二次多項(xiàng)式回歸方程:含氮量 =5.72+0.055A+0.011B-0.011C-0.028AB-0.068AC+0.030BC-0.11A2-0.048B2-0.071C2。

表6 響應(yīng)面優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Box-Behnken design matrix and experimental results

由表7的方差分析可知，該回歸模型達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。模型中的A2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著(P ＜0.001);A、AC、、B2、C2對(duì)響應(yīng)值影響顯著(P ＜0.05)，其他項(xiàng)系數(shù)均不顯著(P＞0.05)，這表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。此模型的決定系數(shù)R2=0.976 2，R2Adj=0.933 3說明響應(yīng)值的變化有97.62%來源于所選變量，該方程與實(shí)際情況擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，能夠正確反映氮含量測(cè)定值與測(cè)定條件催化劑、消化溫度、消化時(shí)間之間的關(guān)系。失擬項(xiàng)P=0.315 2＞0.05，差異不顯著，表明建立的二次多項(xiàng)式回歸模型能運(yùn)用于鮮牛奶氮含量測(cè)定條件的優(yōu)化及預(yù)測(cè)。

2.4.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

對(duì)表7的結(jié)果作響應(yīng)面分析，見圖2～圖4。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis for the regression model

圖2 催化劑、消化溫度對(duì)氮含量測(cè)定影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Responsive surfaces and contours of catalyst，digestion temperature impact on the determination of the nitrogen content

圖3 催化劑、消化時(shí)間對(duì)氮含量測(cè)定影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Responsive surfaces and contours of catalyst，digestion time impact on the determination of the nitrogen content

圖2～圖4直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處?？梢钥闯龃呋瘎┝?A)與消化時(shí)間(C)之間的交互作用最為顯著，其次是消化溫度(B)與消化時(shí)間(C)。比較3組圖可知，催化劑量對(duì)氮含量的測(cè)定影響最顯著，表現(xiàn)為曲線較陡;消化溫度、消化時(shí)間的影響則不明顯。

圖4 催化劑、消化時(shí)間對(duì)氮含量測(cè)定影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Responsive surfaces and contours of digestion temperature，digestion time impact on the determination of the nitrogen content

選擇合適的催化劑量、消化溫度、消化時(shí)間可獲得較高氮含量測(cè)定值，通過Design-Expert8.0.6軟件分析，預(yù)測(cè)最佳測(cè)定條件為:催化劑量8.32 g，消化溫度398.95℃，消化時(shí)間230.27 min，在此條件下，理論氮含量為5.729 3 mgN/mL。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

考慮到儀器的性能和實(shí)際操作的方便，將各測(cè)定條件修正為:催化加量8.3 g，消化溫度399℃，消化時(shí)間230 min，在修正條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8 Stability test results and analysis

由表8可見，在最佳測(cè)定條件下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，測(cè)定值穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)誤差0.005 74，在誤差范圍內(nèi);測(cè)定的平均值為5.721 5 mgN/mL，與理論值的相對(duì)誤差為0.136%，說明響應(yīng)面模型能正確預(yù)測(cè)測(cè)定條件;FOSS法與國標(biāo)法相比較，試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性更高。

2.6 回收率試驗(yàn)(表9)

表9 回收率試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 9 Recovery test results and analysis

由表9可見，采用4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行回收率試驗(yàn)的結(jié)果均在誤差允許范圍內(nèi)，F(xiàn)OSS法與國標(biāo)法相比較，F(xiàn)OSS法在最佳測(cè)定條件下的氮含量測(cè)定值更能正確反映樣品中的真實(shí)值水平。

3 結(jié)論

通過Plackett Burman試驗(yàn)對(duì)影響鮮牛奶氮含量測(cè)定的5個(gè)因素進(jìn)統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選，而后進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，從而確定響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的因素和水平，最后由響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)獲得FOSS-2300全自動(dòng)定氮儀測(cè)定氮含量的最佳條件。結(jié)果表明:催化劑量、消化溫度、消化時(shí)間對(duì)鮮牛奶氮含量測(cè)定的影響不是簡單的線性關(guān)系，由此建立的回歸模型擬合程度良好，理論值和預(yù)測(cè)值基本一致;FOSS法與國標(biāo)法相比，穩(wěn)定性和回收率更高，因此FOSS法可以應(yīng)用于對(duì)鮮牛奶氮含量的測(cè)定，具有實(shí)用價(jià)值。

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