基于HS-SPME-GC-MS法的超高壓處理牡蠣肉中揮發(fā)性成分分析*

王曉謙，秦小明，鄭惠娜，章超樺

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江，524088)

香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis)，我國著名4大養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一。牡蠣不僅因肉質(zhì)鮮美可口受到人們喜愛，同時由于含有大量的糖原、?；撬帷被峒盎钚晕⒘吭?，具有很高的藥用價值。目前國內(nèi)牡蠣主要以鮮食為主，還可以加工成干品、罐頭等，以非熱加工方式處理的牡蠣量很少。

新鮮牡蠣肉呈青白色，質(zhì)地柔軟細嫩，肉味鮮美，經(jīng)過烹飪的牡蠣能產(chǎn)生獨特的誘人香味，牡蠣在生、熟時的風(fēng)味有很大差別，劉輝等［1］利用固相微萃取技術(shù)分析了牡蠣肌肉中的風(fēng)味物質(zhì);劉曉麗等［2］利用SPME-GC-MS聯(lián)用法分析、鑒定牡蠣肉原料和酶解液的揮發(fā)性風(fēng)味成分，探討酶解對牡蠣風(fēng)味的影響;顧聆琳等［3］利用氣相質(zhì)譜法測定了牡蠣中的風(fēng)味物質(zhì);劉文等［4］用電子鼻和頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法(HS-SPME-GC-MS)對不同加熱溫度的牡蠣體液風(fēng)味物質(zhì)進行分析，探討了牡蠣體液揮發(fā)性成分與加工溫度的關(guān)系。而有關(guān)超高壓處理后的牡蠣組織勻漿中風(fēng)味物質(zhì)的報道幾乎是空白。本研究運用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法［5-8］(HS-SPME-GCMS)，以空白組和熱處理組為對照，分析不同超高壓處理的牡蠣組織勻漿中揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

香港牡蠣，購于湛江霞山東風(fēng)水產(chǎn)批發(fā)市場;海水取自湛江東海島龍海天海濱的海水井;真空包裝袋(材質(zhì):PE+PET雙層復(fù)合，厚度:雙面0.14 mm)河北新興塑業(yè)。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L2-600/0.6超高壓設(shè)備，天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司;SJY-UV01G紫外殺菌器，廣州百諾環(huán)保技術(shù)有限公司;HY-002-2A臭氧發(fā)生器，廣州佳環(huán)電器科技有限公司;DZQ單室真空封口機，上海申越包裝機械制造有限公司;九陽料理機(JYL-C020)，九陽股份有限公司;(SHIMADZU QP-2010 Plus)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司;(PAL System)三合一進樣器，瑞士CTC公司;萃取頭65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯，美國Supelco公司。

1.3 樣品前處理

海水的預(yù)處理:海水靜置24 h后抽濾，再經(jīng)過紫外殺菌器(10 W，0.2 T/h)進行殺菌處理，制得無菌海水備用。

牡蠣的預(yù)處理:選取長度12～14 cm的香港牡蠣，用海水洗凈表面泥沙及附著物后，放入預(yù)處理過的海水中，V(牡蠣)∶V(水)=1∶10，通入空氣，輔助臭氧(濃度0.05%)殺菌處理，凈化處理24 h，每4 h換一次無菌海水。凈化處理結(jié)束后人工開殼取牡蠣肉，放入臭氧濃度為0.05%的冰生理鹽水中(4℃)，洗去黏液及黑邊，瀝干表面水分后真空包裝。

牡蠣的處理:將牡蠣分別置于200、400、600 MPa處理20 min(溫度為30℃)，另設(shè)75℃ 8 min加熱處理組和空白組。

樣品的制備:將處理好的牡蠣制成勻漿，準(zhǔn)確稱取4 g，添加至含有1 g NaCl的頂空瓶中。

1.4 實驗條件

1.4.1 固相微萃取條件

萃取溫度控制在60℃，萃取時間為30 min，萃取方式選用直接固相微萃取。

1.4.2 色譜條件

色譜柱:RT-5MS 30 m ×0.25 mm ×0.25 μm 規(guī)格彈性毛細管柱;程序升溫:初始柱溫50℃，保持5 min，然后以5℃/min升至160℃，保持5 min，再以10℃/min升至 250℃，保持 2 min;進樣口溫度250℃;載氣量(He)流量1.0 mL/min;不分流。

1.4.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;接口溫度250℃;離子源溫度230℃;質(zhì)量掃描范圍40～400 amu。

1.5 定性分析

GC-MS數(shù)據(jù)采用計算機譜庫(NISY/WILEY)進行自動檢索，輔助以人工解析圖譜，并結(jié)合已有文獻進行定性分析，峰面積歸一化法計牡蠣組織勻漿樣品中揮發(fā)性成分的含量，僅報道匹配度在80%以上的鑒定結(jié)果［9］。作圖采用Origin8.5處理軟件。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 生鮮牡蠣肉(空白對照)的特征風(fēng)味化合物組成分析

用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法分析生鮮牡蠣肉揮發(fā)性風(fēng)味化合物成分，得到GC-MS總離子流圖，見圖1-a。

圖1 不同樣品揮發(fā)性風(fēng)味化合物GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of volatile compounds in different samples

各組分質(zhì)譜經(jīng)計算機譜庫檢索及資料分析，分析并鑒定揮發(fā)性香氣成分，共檢測到54種成分，將揮發(fā)性成分按照保留時間統(tǒng)計見表1。其中醛類13種、醇類17種、酮類9種、烴類13種、其他2種，相對含量分別為 14.26%、49.60%、20.95%、14.54%、0.64%。

通過利用HS-SPME-GC-MS法分析了生鮮牡蠣特征的氣味物質(zhì)及氣味描述，因萃取溫度較低，所得結(jié)果更貼近生鮮牡蠣的氣味。牡蠣中對氣味影響較大的揮發(fā)性化合物有:1-戊烯-3-醇、1-庚醇、1-戊醇、己醛、庚醛、1，5-辛二烯-3-醇、3-辛酮、2，4-庚二烯醛(E，E)、2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、2，6-壬二烯醛(E，E)、2-十一烷酮、3-壬烯-1-醇，十四醛、2-乙基-呋喃。這些化合物有些具有類似植物的青草、蘑菇味、花香以及黃瓜香氣，有些具有熱帶水果香氣、柑桔類和甜瓜香等水果香氣，還有一些具有牛奶、黃油等油脂奶香氣，也有少部分具有焦味、辛辣等不良氣味，它們的協(xié)同作用構(gòu)成了生鮮牡蠣的氣味特征。

2.2 超高壓處理和加熱處理對牡蠣肉中揮發(fā)性成分的影響

用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法分析不同處理方式牡蠣組織勻漿揮發(fā)性風(fēng)味化合物成分，得到GCMS總離子流圖，見圖1-b～e。

質(zhì)譜經(jīng)計算機譜庫檢索及資料分析，分析并鑒定揮發(fā)性香氣成分，200 MPa處理、400 MPa處理、600 MPa處理及75℃ 8 min處理后分別檢測到54、57、62及62種成分，將揮發(fā)性成分按照結(jié)構(gòu)分類統(tǒng)計見表1。

表1 不同處理方法檢測牡蠣勻漿的SPME-GC-MS分析結(jié)果Table 1 SPME-GC-MS analysis result of oyster tissue homogenates in different samples

續(xù)表1

表2顯示了HS-SPME-GC-MS測定分析出的牡蠣揮發(fā)性物質(zhì)成分。在所有檢測到的91種化合物中，醛27種，醇類有23種，酮類14種，烴類及其他27種。

從表1可以看出，牡蠣的揮發(fā)性物質(zhì)主要可以分為5類:醛類、醇類、酮類、烴類和其他。總體來看，空白組、200 MPa組和400 MPa組的醇類相對含量較高，600 MPa和75℃ 8 min熱處理組的醛類相對含量較高。200 MPa組、400 MPa組和600 MPa組醛類物質(zhì)的相對含量分別為10.98%、18.76%和39.52%，600 MPa組比200 MPa組醛類物質(zhì)相對含量增加了28.54%，即隨著壓力的增大，醛類物質(zhì)相對含量越多;200 MPa組、400 MPa組和600 MPa組醇類物質(zhì)的相對含量分別為55.97%、51.57%和24.60%，600 MPa組比200 MPa組醇類物質(zhì)相對含量減少了31.37%，即隨著壓力的增大，醇類物質(zhì)相對含量減少;200 MPa組、400 MPa組和600 MPa組酮類物質(zhì)和烴類物質(zhì)的相對含量分別為16.01%、13.51%、15.37%和11.38%、12%、14.86%，即隨著壓力的增大，酮類物質(zhì)和烴類物質(zhì)相對含量變化不大。蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的游離氨基酸和胺類化合物與脂肪分解會產(chǎn)生醛類化合物，超高壓會直接導(dǎo)致發(fā)生這種變化。

加熱處理的牡蠣肉醛類物質(zhì)與空白組相比的相對含量降低了22.92%，醇類物質(zhì)和酮類物質(zhì)分別增加了22.56%和5.99%。

牡蠣肉600 MPa處理后醛類物質(zhì)的相對含量(39.52%)比空白組(14.32%)增加了25.2%，與熱處理組(37.24%)沒有明顯差別。牡蠣肉600 MPa處理后醇類物質(zhì)的相對含量(24.60%)比空白組(49.70%)減少了25.1%，與熱處理組(27.14%)沒有明顯差別。超高壓處理和熱處理的揮發(fā)性物質(zhì)中酮類物質(zhì)和烴類物質(zhì)的相對含量沒有明顯變化。這表明壓力達到600 MPa時，揮發(fā)性化合物發(fā)生的變化與熱處理相類似。

2.3 不同加工處理方式對牡蠣肉中幾種主要揮發(fā)性成分的影響

2.3.1 不同加工方式對牡蠣肉中醛類化合物的影響

香港牡蠣的揮發(fā)性化合物中，醛類閾值普遍較低，具有脂肪的香味，所以醛類是影響新鮮牡蠣特征氣味的重要組分，其中飽和的直鏈醛一般呈現(xiàn)出刺激、辛辣，并帶有油和蠟的特征氣味。長鏈醛類由于高沸點對風(fēng)味貢獻小，但是風(fēng)味物質(zhì)重要的前體物。新鮮牡蠣中對香氣影響較大的醛類主要有:2，4-庚二烯醛、2，4-癸二烯醛、壬醛、2-丁烯醛、2，6-壬二烯醛、2-辛烯醛、十四醛、己醛等。600 MPa超高壓處理后的牡蠣肉對香氣影響較大的醛類主要有2，4-己二烯醛、2，4-庚二烯醛、庚醛、己醛、壬醛、2-壬烯醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2，4-十二碳二烯醛、十四醛、2，6-壬二烯醛。75℃8 min熱處理后的牡蠣肉對香氣影響較大的醛類主要有2，4-庚二烯醛、庚醛、己醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、十四醛、2，4-癸二烯醛。

600 MPa壓力處理后醛類大量增加，與空白組相比相對含量明顯增加的有2，4-庚二烯醛、庚醛、己醛、癸醛、4-乙基-苯甲醛、2-癸烯醛、2，6-壬二烯醛，分別增長 6.56%、1.12%、1.37%、0.5%、0.73%、1.99%、1.45%，這幾種物質(zhì)在熱處理之后也有很大的提高，這說明雖然超高壓是非熱加工方式，但壓力達到600 MPa后其揮發(fā)性醛類物質(zhì)的變化與熱處理相似。另外，2-丁烯醛在超高壓及熱處理之后都沒有檢測出，2，4-癸二烯醛 600 MPa超高壓處理減少0.6%，但熱處理之后卻增加了2.88%。

2-己烯醛，庚醛和2-庚烯醛等有著強烈的青草、植物等香氣。己醛有著黃瓜特有的刺激的青草味，2-壬烯醛能呈現(xiàn)出牡蠣特征的奶油香，2，6-壬二烯醛有著牡蠣特征的黃瓜的清香以及動物的脂肪味，閾值只有0.000 06×10-6。辛醛和壬醛呈現(xiàn)出油脂香味，因為辛醛、壬醛是油酸氧化的產(chǎn)物;2，4-癸二烯醛是聚不飽和脂肪酸氧化的主要產(chǎn)物，具有油脂味，還帶有清香氣味;壬醛和2-辛烯醛具有魚腥味。2-戊烯醛呈油脂、青草的氣味，2，4-十二碳二烯醛具有油氣、脂肪和牛奶香氣。十四醛具有強烈桃子似香氣。長鏈醛類本身閾值較高，但卻是某些重要的雜環(huán)類芳香化合物的前體物［10］。而直鏈飽和醛正常情況下具有不愉快的、刺鼻的和讓人感到疼痛的氣味，并伴有油和蠟的頭香味。

2.3.2 不同加工方式對牡蠣肉中醇類化合物的影響

醇類通常具有柔和的芳香、植物香、酸敗和土氣味。醇類化合物可能產(chǎn)生于脂肪酸的次級氫過氧化產(chǎn)物，或脂肪酸的脂氧化酶的作用、脂肪的氧化合羰基的還原作用。由于醇的閾值高，一般對牡蠣氣味貢獻不大［11］。但值得注意的是 1-辛烯-3-醇［13］，俗稱蘑菇醇，在5個樣品中的相對含量分別為 16.70%、21.94%、20.67%、7.93%和7.61%，600 MPa處理與75℃8 min該物質(zhì)的相對含量與其他處理組相比明顯降低，1-辛烯-3-醇貢獻出新鮮牡蠣特有的類似蘑菇的香氣。1-己醇、3-辛醇、3，3-二甲基-4-庚醇、1-壬醇、3-壬烯-1-醇在超高壓和熱處理后未檢測出，其中3-辛醇氣味物質(zhì)在牡蠣中呈現(xiàn)出淡淡的蘑菇味。1，5-辛二烯-3-醇600 MPa和熱處理后相對含量分別減少9.89%和7.35%。2-辛烯-1-醇具有青香、蔬菜樣香氣，使人感覺愉快的果香香韻［10］。

2.3.3 不同加工方式對牡蠣肉中酮類化合物的影響

酮類貢獻出牡蠣甜的花香，果香等氣味，二酮類能呈現(xiàn)出肉香奶油香。酮類化合物可能來源于多不飽和脂肪酸的熱氧化降解、氨基酸的降解或微生物的氧化［12］。但酮類閾值較高，對牡蠣整體風(fēng)味的貢獻較小。

其中，3，5-辛二烯-2-酮是和2-壬酮是強氣味劑，對新鮮牡蠣氣味影響較大。有研究證實2，3-辛二酮是肉制品預(yù)煮異味的主要貢獻物之一，來源于脂質(zhì)氧化［14］。3-辛酮有著溫和的水果味、熟香蕉味，同時呈似熏衣草的草藥氣味［10］。

2.3.4 不同加工方式對牡蠣肉中烴類和其他化合物的影響

本實驗中還檢測出了烴類物質(zhì)，烴類主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂。各種烷烴(C6～C19)存在于甲殼類和魚類的揮發(fā)物中，但它們具有較高的閾值，對牡蠣勻漿整體風(fēng)味的貢獻不大，可能有助于提高牡蠣整體香味效果［15］。

此外，2-乙基-呋喃也對牡蠣的氣味有顯著的影響，有焦香香氣，低濃度時體現(xiàn)出甜香味。

綜上所述，對牡蠣氣味影響最大的是醛類物質(zhì)。與空白組相比，超高壓產(chǎn)生變化的原因可能是超高壓破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，熱處理產(chǎn)生肉香味的原因可能脂肪、蛋白質(zhì)的降解以及Maillard反應(yīng)。

3 結(jié)論

利用頂空固相微萃取進樣，經(jīng)GC-MS分析，鑒定出生鮮、超高壓及熱處理牡蠣肉的揮發(fā)性成分共91種。生鮮牡蠣肉中共檢測到54種揮發(fā)性化合物，醛類、醇類、酮類和烴類的相對含量分別為14.26%，49.60%，20.95%和14.54%;醛類閾值普遍較低，是影響新鮮牡蠣特征氣味的重要組分。600 MPa組比200 MPa組醛類物質(zhì)相對含量增加了28.54%，600 MPa組比200 MPa組醇類物質(zhì)相對含量減少了31.37%，酮類物質(zhì)和烴類物質(zhì)隨壓力增大變化不大。牡蠣肉600 MPa處理后醛類物質(zhì)和醇類物質(zhì)的相對含量比空白組分別增加了25.2%和減少了25.1%，與熱處理組的醛類和醇類物質(zhì)總的相對含量無明顯差別。壓力達到600 MPa后其揮發(fā)性物質(zhì)的變化與熱處理相似。牡蠣肉風(fēng)味發(fā)生變化的原因主要是脂肪、蛋白質(zhì)的降解以及Maillard反應(yīng)。頂空固相微萃取與GC-MS聯(lián)用技術(shù)定性分析，為牡蠣肉的揮發(fā)性成分研究和產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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