采用復合保護劑提高重組普魯蘭酶穩(wěn)定性*

趙偉超，聶堯，穆曉清，張榮珍，徐巖

(江南大學生物工程學院，教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇無錫，214122)

普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)是一類催化未修飾底物(如支鏈淀粉、普魯蘭及相關聚合物)的α-1，6-葡萄糖苷鍵水解的脫支酶。普魯蘭酶在工業(yè)中的主要功能是提高淀粉糖化過程的水解效率，這是由于在糖化過程中，當普魯蘭酶與葡萄糖淀粉酶共同使用時，普魯蘭酶可特異性水解支鏈淀粉的分支點，而葡萄糖淀粉酶只需水解線性的α-1，4-葡萄糖苷鍵，因此使用普魯蘭酶可加速糖化過程并減少葡萄糖淀粉酶的用量［1-4］。

在工業(yè)化酶制劑中，酶的熱穩(wěn)定性是關鍵的一個因素。酶的熱穩(wěn)定性高不僅可以延長酶的儲存時間，而且可以使酶在較高反應溫度下延長酶的反應時間，提高生產(chǎn)效率，從而有效地降低生產(chǎn)成本。當前，提高酶穩(wěn)定性主要的方法有:蛋白質(zhì)工程、化學修飾、酶的固定化和添加保護劑等［5-8］。在液體酶中直接加入穩(wěn)定劑是一種常用的經(jīng)濟有效的方法。如郝秋娟等人在β-葡聚糖酶溶液中添加大分子親水型多糖黃原膠、動物蛋白明膠、甘油、NaCl可明顯提高β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性［9］;Coasta等人研究了多種添加劑對來自桿菌的過氧化氫酶的影響，發(fā)現(xiàn)在4℃和30℃，甘油和聚乙烯乙二醇能增加其儲存穩(wěn)定性［10］;Zhi等通過向氯化物過氧化物酶中添加PEG200、甘油、海藻糖等，顯著地提高了其儲存穩(wěn)定性［11］;張巧等在液體D-塔格糖3-差向異構酶中添加0.3%尼泊金甲酯，以及2 mmol/L MgSO4，6%果糖，4%肌醇，在25℃儲存條件下，酶的半衰期得到了顯著提高［12］。

在工業(yè)化生產(chǎn)中，由于淀粉糖化過程需要在較高的溫度(55～65℃)、微酸性(pH 4.5～5.5)條件下進行［13］，這就需要普魯蘭酶要在此條件下有良好的穩(wěn)定性。目前國際上普魯蘭酶的工業(yè)化生產(chǎn)主要被丹麥的諾維信公司所壟斷，杰能科公司也有商品化的普魯蘭酶。而在我國，普魯蘭酶僅局限于實驗室研究，通過添加劑提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的研究比較有限。本研究室，通過前期的工作，已經(jīng)實現(xiàn)了重組普魯蘭酶(PUL)的高效表達［14］。為了進一步實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，本研究分析各種保護劑如糖類、多元醇類、蛋白類、金屬離子以及表面活性劑等化學物質(zhì)對PUL熱穩(wěn)定性的影響，并通過保護劑與防腐劑的復配以顯著提高其應用穩(wěn)定性及其儲存穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:重組普魯蘭酶(PUL，1 980 U/mL)，來自本實驗室構建和保存的重組菌E.coli BL21/pET-20bpul;甘油、明膠、NaCl、苯甲酸鈉、山梨酸鉀等均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

設備:Multiskan Spectrum型酶標儀，美國Thermo公司;Avanti J-E型高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司;Direct-Q3型超純水儀，美國Millipore公司;MS型分析天平、FE20型pH計，瑞士Mettler Toledo公司;APV2000型高壓均質(zhì)機，丹麥APV公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液的制備

以工程菌E.coli BL21/pET-20b-pul為出發(fā)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)重組普魯蘭酶。細菌發(fā)酵培養(yǎng)后，將發(fā)酵液離心(10 000 r/min，20 min，4℃)，細胞用適當體積的生理鹽水重懸后高壓(100 MPa，3～5 min)破碎，再離心(10 000 r/min，30 min，4 ℃)，上清液用(NH4)2SO440%進行鹽析，再離心(10 000 r/min，30 min，4 ℃)，沉淀用醋酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 4.5)復溶，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，即為PUL粗酶液。

1.2.2 普魯蘭酶酶活力的測定

酶活測定方法根據(jù)Jinho-Kang［15］的方法稍做修改:反應溫度改為60℃，緩沖體系為0.1 mol/L pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液。1個單位的普魯蘭酶活力定義為在測定條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶的量。所有酶活測定結(jié)果為3次重復平行試驗數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.3 PUL的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

將 PUL 酶液在不同溫度下(45、50、55、60、65 ℃)保溫1 h，間隔取樣測定酶活保留率;配制不同pH(3～13)的乙酸-乙酸鈉緩沖液，將冷凍干燥后的粗酶粉溶解于2 mL不同pH的乙酸-乙酸鈉緩沖液，于30℃恒溫水浴保藏12 h，測定酶活保留率。

1.2.4 單因素保護劑對PUL熱穩(wěn)定性的影響

分別配制離子濃度(Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+)為0.1 mol/L 的溶液，然后分別與等體積的PUL酶液混合，于40℃恒溫水浴保藏48 h，分別測定24 h和48 h酶活保留率;分別配制4 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇和體積分數(shù)為10% 的甘油，然后分別與等體積的PUL酶液混合，于40℃恒溫水浴保藏48 h，分別測定24 h和48 h酶活保留率;分別配制10 g/L的明膠、黃原膠和4 mL/L的Tween20、Tween80，然后分別與等體積的PUL酶液混合，于40℃恒溫水浴保藏48 h，分別測定24 h和48 h酶活保留率，再分別從各類保護劑選出較好的進行單因素濃度優(yōu)化實驗。

1.2.5 復合保護劑組分的優(yōu)化

根據(jù)單因素的變化趨勢，選出各因素的濃度水平范圍，設4因素3水平L9(34)的正交試驗來確定復合保護劑的配方。

表1 復合保護劑正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.6 復合保護劑的添加對PUL的熱穩(wěn)定性的影響以及PUL的熱失活動力學參數(shù)

將添加優(yōu)化后復合保護劑的PUL酶液在不同溫度下(45、50、55、60、65℃)保溫，間隔取樣測定酶活保留率。

失活速率常數(shù)(k)的測定:對于一級反應，由速率方程lnA=-kt可求得k，其中A，酶活保留率(%);t，失活時間。半衰期(t1/2)的測定:特定溫度下酶活降低一半所需要的時間，對于一級反應，t1/2=0.693/k。

1.2.7 復合保護劑和防腐劑對PUL常溫保藏的影響

保藏實驗置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行，在酶液中分別添加優(yōu)化后的復合保護劑和防腐劑，其中防腐劑是1 g/L的山梨酸鉀和1 g/L的苯甲酸鈉，對照組不添加保護劑和防腐劑，在不同時間取樣測定酶活保留率，以初始酶活力為100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 PUL的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

由圖1A可知，低于55℃時，酶活保持相對穩(wěn)定，失活較小;超過60℃時，酶活迅速下降，說明當溫度高于60℃時，該酶的熱穩(wěn)定性較差。由于在實際生產(chǎn)中，糖化需要在較高溫度下進行，因此需要提高PUL的熱穩(wěn)定性，在提高酶熱穩(wěn)定性實驗中，選取40℃進行保溫，保證長時間保溫酶活不至于下降很多。圖1B表明，pH在4～10，酶活保留率全在90%以上，而pH低于3或者高于11酶活迅速下降，可見該酶的pH穩(wěn)定性較好，符合工業(yè)上的應用。

圖1 PUL的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性Fig.1 Thermostability and pH stability of PUL

2.2 不同保護劑對PUL熱穩(wěn)定性的影響

在特定條件下，從不同種類的保護劑中，選出幾種顯著提高PUL熱穩(wěn)定性的單一保護劑，進而進行單因素濃度實驗。從圖2A可以看出，不同的金屬離子對PUL的熱穩(wěn)定性有不同的影響，其中Na+、K+的效果不是很明顯，Mg2+、Ca2+、Co2+和Mn2+對酶的熱穩(wěn)定性有顯著的提高，而Zn2+、Cu2+對酶活有明顯的抑制作用。添加 Ca2+，48 h后酶活保留率為72.37%，相比對照組(酶活保留率為56.84%)提高了27.32%。圖2B和2C為糖、醇、大分子助劑和表面面活性劑對PUL熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明:這些物質(zhì)對PUL的熱穩(wěn)定性都有一定的促進作用，其中葡萄糖、甘油、明膠、Tween20和Tween80能夠有效地促進PUL的熱穩(wěn)定性。根據(jù)以上結(jié)果，選出4類不同的保護劑(Ca2+、甘油、明膠、Tween20)進行濃度梯度優(yōu)化。圖3為不同濃度的Ca2+、甘油、明膠和Tween20對PUL熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明酶活保留率并不是隨著保護劑濃度的上升而增加，而是到達一定程度后酶活保留率卻下降或趨于不變。如圖3A所示。

圖2 不同保護劑對PUL熱穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects on thermal stability of PUL with different protective additives

圖3 不同濃度單一保護劑對PUL熱穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects on thermostability of PUL in the presence of single-protective additive with different concentrations

2.3 復合保護劑配比的優(yōu)化

采用效果較佳的4種保護劑甘油(A)、Ca2+(B)、Tween20(C)和明膠(D)設計4因素3水平的正交試驗，采用L9(34)正交表，其結(jié)果如表2所示。

表2 復合保護劑正交試驗直觀分析Table 2 Range analyses of orthogonal experimental design for combination additive

由表2結(jié)果可以得出各影響因素的順序為:Tween20(C)＞明膠(D)＞甘油(A)＞Ca2+(B)，對表2的結(jié)果進行方差分析(見表3)，影響PUL溫度穩(wěn)定性的主要因素為 C(Tween20)、D(明膠)和 A(甘油)，而B(Ca2+)的影響不顯著。綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果，得到最優(yōu)方案為A1B2C2D3，也就是Tween20 2 mL/L，明膠6 g/L，甘油5%，Ca2+0.1 mol/L，在此條件下，保溫48 h后，酶活保留率為94.68%。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analyses of orthogonal experiment

2.4 復合保護劑的添加對PUL的熱穩(wěn)定性的影響以及PUL的熱失活動力學參數(shù)

如圖4可知，加入復合保護劑后，不同溫度保溫1 h后酶活保留率均高于未添加保護劑的酶活保留率，尤其是 55、60和 65℃，酶活保留率分別為98.54%、96.07%和 87.42%，較對照(94.12%、10.78%、7.68%)高出4.42%、85.29%和79.74%，這對于PUL在糖化過程中更為有利。

圖4 添加復合保護劑的PUL熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermostability of PUL in the presence of combination additive

表4為PUL的熱失活動力學參數(shù)，從表中可以看出，在55℃下，未加保護劑的PUL的半衰期是11 h，而加入特定的保護劑后，熱失活速率常數(shù)大幅下降，半衰期為47 h，提高了3.27倍，表明復合保護劑的加入能顯著提高酶的熱穩(wěn)定性。

表4 PUL的熱失活動力學參數(shù)Table 4 Kinetic parameters for thermal inactivation of PUL

據(jù)文獻資料［16-18］，保護劑主要通過以下方式來提高酶的熱穩(wěn)定性:金屬離子對酶活的影響可能與維持酶的分子結(jié)構與活性中心有關;糖和多元醇類物質(zhì)屬于多羥基化合物，加入酶的水溶液后，會與水分子相互作用，改變水的表面張力，使酶與水之間形成溶劑層，增強酶的穩(wěn)定性;明膠對酶的穩(wěn)定性的提高，可能是由于明膠是富含多種氨基酸的多聚陽離子膠質(zhì)結(jié)構，為酶提供還原性環(huán)境，利于酶保持天然構象及酶活;Tween20作為一種表面活性劑，可以改變酶分子所處的微環(huán)境，提高酶的穩(wěn)定性。

2.5 PUL的儲存穩(wěn)定性

酶的儲存穩(wěn)定性與酶的存在形式有關，大部分酶在固體狀態(tài)下相對比較穩(wěn)定，而液體酶在儲存的過程中很容易被微生物污染，喪失其酶活性，所以通常不容易長期保存。然而在實際的工業(yè)生產(chǎn)過程中，冷凍干燥的成本較高，相反，選擇添加保護劑和防腐劑，成本低、易操作、儲存穩(wěn)定性也比較好。因此選擇添加保護劑和防腐劑提高液體PUL的儲存穩(wěn)定性對該酶的應用有著重要的意義。

如圖5所示，在25℃條件下，未添加任何保護劑和防腐劑的PUL在保存90 d后酶活保留率為34.86%;含有復合保護劑的PUL在保存90 d后酶活保留率為78.64%;含有復合保護劑和防腐劑的PUL在保存90 d后酶活保留率為85.25%，相比對照提高了1.45倍。并且，加入防腐劑能夠有效地抑制雜菌在液體酶液中繁殖，酶液染菌機會減少，最終酶制劑澄清、不發(fā)臭。

圖5 添加保護劑和防腐劑對PUL貯存穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects ofcombination additive and preservative on the stability of PUL preparation

3 結(jié)論

本研究分析了在重組普魯蘭酶酶液中添加金屬離子、多羥基醇類、大分子物質(zhì)、表明活性劑等化學物質(zhì)對酶熱穩(wěn)定性的影響，篩選出了對酶穩(wěn)定性作用比較大的4種穩(wěn)定劑(明膠、甘油、Tween20、Ca2+)，并在此基礎上通過正交優(yōu)化得到的最終復配方法為:Tween20 2 ml/L，明膠6 g/L，甘油5%，Ca2+0.1 mol/L，在此條件下，酶活保留率為94.68%。

并考察了復合保護劑對PUL熱穩(wěn)定性的影響以及PUL的熱失活動力學參數(shù)，在60℃下，添加保護劑的PUL保溫1 h后的酶活保留率為96.07%，較對照高出85.29%。而在55℃下，未加保護劑的PUL的半衰期是11 h，而加入特定的保護劑后，熱失活速率常數(shù)大幅下降，半衰期為47 h，提高了3.27倍，表明復合保護劑的加入能顯著提高酶的熱穩(wěn)定性。

在液體酶中添加防腐劑(1 g/L山梨酸鉀和1 g/L苯甲酸鈉)能有效抑制酶液中雜菌污染，提高酶液的儲存穩(wěn)定性。最終在25℃保藏90 d后，含有復合保護劑和防腐劑的PUL酶活保留率高達85.25%，相比對照提高了1.45倍，達到了工業(yè)保藏的需求。

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